Получение интерферона методом генной инженерии. Научная электронная библиотека. Плесневые грибы и сельское хозяйство

03.03.2020

Интерферон относится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфицированные одним вирусом, становились нечувствительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладающим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.

Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединительной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ-интерфероны.

Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами и он получил название лейкоцитарного; бета-интерферон называют фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами - клетками соединительной ткани, а гамма-интерферон - иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови держится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 международная единица - ME - это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД 50 вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили название интерфероногенов.

Помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действия интерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.

Применение интерферона . Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или поступать в организм извне. Поэтому его используют с профилактической целью при многих вирусных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепатиты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и заболеваний, связанных с иммунодефицитами.

Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффективен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.

Получение интерферона . Получают интерферон двумя способами: а) путем инфицирования лейкоцитов или лимфоцитов крови человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конструируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом - путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, полученный генно-инженерным способом, носит название рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил официальное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.

Рекомбинантный интерферон нашел широкое применение в медицине как профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.

Плесневые грибы - продуценты антибиотиков. Особенности строения клетки и цикла развития при ферментации. Антибиотики, образуемые плесневыми грибами.

Биотехнология (Быков 2009) с.28-40.

Пле́сневые грибы́ , или пле́сень - различные грибы (в основном, зиго- и аскомицеты) образующие ветвящиеся мицелии без крупных, легко заметных невооруженным глазом, плодовых тел.

Семейства и виды плесневых грибов

Penicillium spp.
Aspergillus
Moniliaceae
Dematiaceae
Fusarium
Acremonium
Scytalidium dimidiatum (Nattrassia magniferae )
Onychocola canadensis

Распространение в природе

Плесневые грибы распространены повсеместно. В основном, обширные колонии вырастают в тёплых влажных местах, в питательных средах.

Штамм (от нем. Stammen , буквально - происходить) - чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и в определенном месте. Поскольку многие микроорганизмы размножаются митозом (делением), без участия полового процесса, по существу, виды у таких микроорганизмов состоят из клональных линий, генетически и морфологически идентичных исходной клетке. Штамм не является таксономической категорией, наинизшим таксоном у всех организмов является вид, один и тот же штамм не может быть выделен второй раз из того же источника в другое время.

Отнесение микроорганизма к определённому виду происходит на основе достаточно широких признаков, таких как тип нуклеиновой кислоты и строение капсида у вирусов; способности расти на определённых углеводородах и тип выделяемых продуктов обмена веществ, а также консервативных последовательностях генома у бактерий. Внутри вида существуют вариации относительно, размера и формы бляшек (негативные «колонии» вируса) или колоний микроорганизма, уровню продукции ферментов, наличию плазмид, вирулентности и т. п.

В мире не существует общепризнанной номенклатуры названия штаммов, и используемые названия достаточно произвольны. Как правило, они состоят из отдельных букв и цифр, которые записываются после видового названия. Например, один из самых известных штаммов кишечной палочки - E. coli K-12.

Плесневые грибы достаточно широко используются человеком.

Штаммы гриба Aspergillus niger применяются для производства лимонной кислоты из сахаристых веществ
Штаммы Botrytis cinerea («Благородная гниль») участвует в созревании некоторых вин (херес).
Другие виды плесеней (т. н. «благородная плесень») используются для выделки специальных сортов сыра (рокфор, камамбер).
Часто плесень поражает плодовые тела съедобных грибов и делает их непригодными для сбора. Но иногда такие грибы становятся особыми объектами грибной охоты, см. о «грибах-лобстерах» в статье Hypomyces lactifluorum .

Вред от плесневых грибов

Опасность для человека

Микотоксины и антибиотики

Многие плесневые грибы вырабатывают вторичные метаболиты -антибиотики и микотоксины, угнетающе или токсично действующие на другие живые организмы. Наиболее известны следующие вещества

Микотоксины:

Афлатоксин

Антибиотики:

Пенициллин
Цефалоспорины
Циклоспорин

Многие антибиотики вынужденно используются в концентрациях, близких к токсическим. Так, антибиотики гентамицин, стрептомицин, дигидрострептомицин, канамицин и другие могут оказать нефро- и ототоксическое действие.

Патогены

Некоторые плесневые грибы могут вызывать заболевания животных и человека - аспергиллёзы, онихомикозы и другие.

Плесневые грибы и сельское хозяйство

Некоторые плесневые грибы, существенно снижая урожай, могут оказывать неблагоприятное действие на здоровье сельскохозяйственных животных.

Грибы поражают запасы зерна, фураж, солому и сено. Иногда продукты становятся непригодными к использованию из-за токсичности метаболитов гриба.

При сильном развитии плесневых грибов в соломе возможно саморазогревание и даже воспламенение стогов.

Механизмы резистентности

У микроорганизма может отсутствовать структура на которую действует антибиотик (например бактерии рода микоплазма (лат. Mycoplasma ) нечувствительны к пенициллину, так как не имеют клеточной стенки);
Микроорганизм непроницаем для антибиотика (большинство грам-отрицательных бактерий невосприимчивы к пенициллину G, поскольку клеточная стенка защищена дополнительной мембраной);
Микроорганизм в состоянии переводить антибиотик в неактивную форму (многие стафилококки (лат. Staphylococcus ) содержат фермент β-лактамазу, который разрушает β-лактамовое кольцо большинства пенициллинов)
Вследствие генных мутаций, обмен веществ микроорганизма может быть изменён таким образом, что блокируемые антибиотиком реакции больше не являются критичными для жизнедеятельности организма;
Микроорганизм в состоянии выкачивать антибиотик из клетки [источник не указан 85 дней ] .

Применение

Антибио́тики (от др.-греч. ἀντί - anti - против, βίος - bios - жизнь) - вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших.

По ГОСТ 21507-81 (СТ СЭВ 1740-79)

Антибиотик - вещество микробного, животного или растительного происхождения, способное подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель.

Антибиотики природного происхождения чаще всего продуцируются актиномицетами, реже - немицелиальными бактериями.

Некоторые антибиотики оказывают сильное подавляющее действие на рост и размножение бактерий и при этом относительно мало повреждают или вовсе не повреждают клетки макроорганизма, и поэтому применяются в качестве лекарственных средств.

Некоторые антибиотики используются в качестве цитостатических (противоопухолевых) препаратов при лечении онкологических заболеваний.

Антибиотики не воздействуют на вирусы, и поэтому бесполезны при лечении заболеваний, вызываемых вирусами (например, грипп, гепатиты А, В, С, ветряная оспа, герпес, краснуха, корь).

Терминология

Полностью синтетические препараты, не имеющие природных аналогов и оказывающие сходное с антибиотиками подавляющее влияние на рост бактерий, традиционно было принято называть не антибиотиками, а антибактериальными химиопрепаратами. В частности, когда из антибактериальных химиопрепаратов известны были только сульфаниламиды, принято было говорить обо всём классе антибактериальных препаратов как об «антибиотиках и сульфаниламидах». Однако в последние десятилетия в связи с изобретением многих весьма сильных антибактериальных химиопрепаратов, в частности фторхинолонов, приближающихся или превышающих по активности «традиционные» антибиотики, понятие «антибиотик» стало размываться и расширяться и теперь часто употребляется не только по отношению к природным и полусинтетическим соединениям, но и к многим сильным антибактериальным химиопрепаратам.

Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов. Экспрессия генов, встроенных в плазмиду.

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих главным образом в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций. Цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции, существующую наряду с нервной и эндокринной системами поддержания гомеостаза, причем, все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы.

История изучения цитокинов началась в 40-е годы ХХ века. Именно тогда были описаны первые эффекты кахектина – фактора, присутствовавшего в сыворотке крови и способного вызывать кахексию или снижение веса тела. В дальнейшем данный медиатор удалось выделить и показать его идентичность фактору некроза опухолей (ФНО). За последние два десятилетия клонированы гены большинства цитокинов и получены рекомбинантные аналоги, полностью повторяющие биологические свойства природных молекул. Сейчас известно уже более 200 индивидуальных веществ, относящихся к семейству цитокинов.

К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы (КСФ), хемокины, трансформирующие ростовые факторы; фактор некроза опухолей; интерлейкины со сложившимися исторически порядковыми номерами и некоторые другие эндогенные медиаторы. Интерлейкины, имеющие порядковые номера, начиная с 1, не относятся к одной подгруппе цитокинов, связанных общностью функций. Они в свою очередь могут быть разделены на провоспалительные цитокины, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, отдельные регуляторные цитокины.

Классификация цитокинов может проводиться по их биохимическим и биологическим свойствам, а также по типам рецепторов, посредством которых цитокины осуществляют свои биологические функции. Ниже приведена объединенная структурно-функциональная классификация, где все цитокины разделены на группы, в первую очередь с учетом их биологической активности, а также указанных выше особенностей строения молекул цитокинов и их рецепторов [Симбирцев А.С., 2004].

Классификация цитокинов

1. Интерфероны I типа (ИФН a,b,d,k,w,t, ИЛ-28, ИЛ-29 (ИФН l));

2. Колониестимулирующие факторы, гемопоэтины:

– Фактор стволовых клеток;

– Лиганды gp140 (ИЛ-3, ИЛ-5, ГМ-КСФ);

– Эритропоэтин, тромбопоэтин.

3. Семейство фактора некроза опухолей (ФНО, лимфотоксины α и β);

4. Суперсемейство интерлейкина-1 и фактора роста фибробластов (ФРФ):

– Семейство ФРФ

– Семейство ИЛ-1 (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-33 и др.).

5. Семейство интерлейкина-6 (ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-31).

6. Семейство интерлейкина-10 (ИЛ-10,19,20,22,24,26)

7. Cемейство интерлейкина-12 (ИЛ-12,23,27)

8. Цитокины Т-хелперных клонов и регулирующие функции лимфоцитов (ИЛ-2, ИЛ-4-5, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-21, ИФНg)

9. Семейство интерлейкина 17 (ИЛ-17A, B, C, D, E, F)

10. Хемокины.

11.Факторы роста:

– Суперсемейство фактора роста нервов, тромбоцитарного ростового фактора и трансформирующих ростовых факторов

– Семейство эпидермального ростового фактора (ЭРФ, ТРФα и др.);

– Семейство инсулиноподобных ростовых факторов (ИРФ-I, ИРФ-II).

Цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции основных функций организма, существующую наряду с нервной и эндокринной регуляцией и связанную в первую очередь с поддержанием иммуного гомеостаза при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют двустороннюю взаимосвязь между факторами неспецифической защиты и специфическим иммунитетом.

В клинической практике существует три основных направления использования цитокинов:

1. цитокиновая терапия для активации защитных реакций организма, иммуномодуляции, либо восполнения недостатка эндогенных цитокинов;

2. антицитокиновая иммуносупрессивная терапия, направленная на блокирование биологического действия цитокинов и их рецепторов;

3. цитокиновая генотерапия в целях усиления противоопухолевого иммунитета или коррекции генетических дефектов в системе цитокинов.

Цитокины используются в клинической практике как для системного, так и для местного применения. Системное введение оправдывает себя в тех случаях, когда нужно обеспечить действие цитокинов в нескольких органах для боле эффективной активации иммунитета либо активировать клетки-мишени, расположенные в разных частях организма. Наибольшее клиническое применении в настоящее время нашли цитокины из группы интерферонов (ИФН), прежде всего альфа-ИФН и бета-ИФН, в меньшей степение гамма-ИФН.

Интерфероны – группа белков с противовирусным действием, вырабатываемая эукариотическими клетками в ответ на внедрение в них ряда биологических агентов – интерфероногенов (РНК-геномные вирусы, двунитчатые РНК, различные полианионы, бактериальные ЛПС).

ИФН обусловливают разнообразные эффекты, проявляющиеся как на клеточном, так и на системном уровне. Для ИФН характерно наличие трех основных эффектов – неспецифического противовирусного, противоопухолевого и иммуномодулирующего. Интерфероны обладают осуществляют ингибицию репродукции многих вирусов. Противовирусное действие интерферона основывается на подавлении соединения вирусной РНК с рибосомами клетки, что приводит к невозможности осуществления репродукции вируса в клетке.

В 70-х годах все ИФН подразделяли на 2 типа: индуцированные вирусами (лейкоцитарный и фибробластный), которые относили к первому типу и индуцированные мутагенами (иммунный) - ко второму. В настоящее время эта классификация утратила свое значение. В 1980 г. комитетом экспертов Всемирной организации здравоохранения была принята и рекомендована к использованию классификация, согласно которой все ИФН человека подразделяют на 3 класса. Они кодируются различными генами и имеют характерную для каждого класса последовательность аминокислот, из которых построены их молекулы. При наличии рекомбинантных вариантов ИФН их обычно обозначают римскими буквами.

Таблица 11- Классификация интерферонов человека

В настоящее время все полученные знания о ИФН можно обобщить в науку «интерфенология», которая включает теоретические и практические (медицинские и фармацевтические) аспекты этой проблемы. В последнее десятилетие произошло 4 важнейших события в интерфенологии (выделены проф. Ф. И. Ершовым, 1996):

Сформулировано понятие «система интерферона» и выявлены ее прямые и обратные связи с системами иммунитета и нейроэндокринной системой;

Открыта множественность генов ИФН-ct (более 20 в клетках человека);

С помощью современных технологических приемов усовершенствованы существующие и созданы препараты ИФН нового поколения, прошли апробацию оригинальные индукторы ИФН;

Определены показания и противопоказания для клинического использования ИФН и их индукторов при вирусных и невирусных заболеваниях.

В качестве индуктора интерфероногенеза используют вакцинный штамм вируса болезни Ньюкасла или вирус Сендай. Предварительное культивирование вирусов проводят в развивающихся 9-11 сут. куриных эмбрионах. Основные технологические операции: овоскопия, отбраковка, инкубирование куриных эмбрионов, введение инфекционной взвеси в аллантоисную полость с последующим инкубированием в течение 48-72 часов и стягиванием инфицированной жидкости у погибших куриных эмбрионов. Вирусосодержащую аллантоисную жидкость центрифугируют

Очень важной операцией, определяющей качество готового препарата, является удаление из лейкоконцентрата примесей эритроцитов (стадия 1). Наиболее полно устраняет присутствие эритроцитов в лейкоконцентрате их избирательный лизис раствором хлористого аммония в физиологической концентрации.

Таблица 12- Технологическая схема биосинтеза ИФН-а

Технологическая стадия	Условия
1. Выделение лейкоцитов	Фракционирование лейкомассы с декстра-
	ном и поливиниловым спиртом с после-
	дующим гемолизом. При этом образуется 3
	слоя. 2 верхних слоя подвергают центрифу-
	гированию и ресуспендированию осадка в
	питательной среде.
2. Прайминг (активирование	Лейкоциты 10-20 млн/мл в среде № 199 с
метаболизма лейкоцитов)-	5% плазмы донорской крови, 3 ед/мл,
2-10 ч, 37,5°С	0,0015 ед/мл инсулина, 200 МЕ/мл нативного
	ИФН
3. Введение вируса индуктора
3.1.Индукция 1 ч, 37,5°С	Вирус болезни Ньюкасла (ВБН), в дозе 5
	РЦЦ 50 на 1 лейкоцит
3.2.Отделение неабсорбиро-	Центрифугирование 600х д - 15 мин.,
вавшегося вируса	сбор осадка индуцированных клеток.
4. Биосинтез 18 ч, 37,5°С	Суспензионная культура Лейкоциты 6 млн/мл в среде № 199 с 5% гаммаглобулиновой плазмой, 5мл натрия сукцината, бикарбонат натрия до рН 7,5, антибиотики. Выход ИФН-а 3-4 ME на 1 тыс. лейкоцитов.
5.Инактивация вируса интерферона	Доведение рН среды до 2,2-2,4 и экспозицией полуфабриката не менее 7 суток.
6. Очистка интерферона	Поэтапно: осветляющая, ультрафильтрация, стерилизующая фильтрация

На этапе культивирования лейкоцитов (стадия 2) лейкоконцентрат ресуспендируют в культуральной жидкости, которая, помимо основных компонентов, содержит некоторые белки сыворотки крови, без которых биосинтез ИФН практически не происходит. Также установлено, что при культивировании лейкоцитов, особенно при большой плотности суспензии (10 7 клеток/мл), в них активируются метаболитические процессы, что сопровождается образованием кислых продуктов. В связи с этим важно в период прайминга и биосинтеза ИФН сохранять рН среды в оптимальных пределах. Для поддержания рН среды на необходимом уровне к среде добавляют различные вещества, обладающие буферной емкостью.

Оптимальные условия при выработке ИФН (стадия 4) создаются при культивировании лейкоцитов при 37-37,5°С. Снижение температуры инкубирования до 35°С и ниже, или, напротив, повышение ее до 38°С и выше приводило значительному ослаблению продукции ИФН.

ИФН-а может продуцироваться как в стационарных условиях культивирования, так и в культурах с постоянным перемешиванием клеток. Считается, что клетки во взвешенном состоянии более интенсивно вырабатывают ИФН-а. Большое значение для выживания клеток в суспензионных культурах имеет форма сосудов, высота слоя жидкости и достаточные количества кислорода в воздушной среде. Оптимальные условия для получения титров ИФН-а создаются при культивировании лейкоцитов в круглодонных колбах, накрытых фольгой, заполненных клеточной взвесью наполовину, при постоянном перемешивании. Предварительная обработка лейкоцитов малыми дозами ИФН-а приводила к увеличению выхода ИФН в 3-10 раз.

После ресуспендирования лейкоциты индуцируют аллантоисными (без оболочки) вирусами болезни Ньюкасл или Сендай. После инкубации в течение 20 часов при температуре 37,5°С, во время которой преимущественное значение имеет поддержание жизнеспособности культур и высокого метаболизма клетки при постоянстве рН, клетки отделяют низкоскоростным центрифугированием (2 000 об/мин.) в течение 40 минут. Активность интерферона в препаратах, полученных в результате описанной процедуры, составляют 30-200 000 ЕД/мл.

В современной биотехнологии все более широко используются методы генной инженерии. Уже во многих лабораториях мира успешно получают и интегрируют в генетический аппарат культивируемых бактериальных или соматических клеток гены, кодирующие образование ряда биологически активных веществ.

Функциональные гены для биотехнологического производства воссоздают методом обратной транскрипции или синтезируют из отдельных нуклеотидов, выделяя из ДНК соответствующих хромосом.

Опыты по переносу генов ИФН человека в бактериальные клетки были начаты в конце 70-х годов. Почти одновременно в 3 научно-исследовательских группах: в Институте молекулярной биологии I Цюрихского университета под руководством Вейсмана, в отделе биохимии Института по исследованию рака в Токио под руководством Т.Танигучи и в США филиалом фирмы «Genentech» под руководством Дж. Геддела.

Все три группы исследователей использовали для клонирования метод обратной транскрипции мРНК интерферонов. В качестве примера рассмотрим ход экспериментов группы Вейсмана.

Для клонирования гена а-ИФН в качестве исходного материала использовали фракцию 12 S поли (А) мРНК (информационная аденилированная РНК), полученную из клеток лейкоцитов, индуцированных вирусом Сендай. На базе информационной РНК получена комплементарная ей ДНК, состоящая из 2 цепей. Полученная двухспиральная ДНК была расщеплена с помощью рестриктаз путем образования липкого конца олиго-dG. Аналогичная операция была проведена с плазмидой с образованием липкого олиго-dС-конца. С помощью лигаз осуществлено встраивание комплементарного ДНК, содержащей информацию о структуре а-ИФН в плазму pBR322.

Эта плазмида несет в своем составе гены, определяющие устойчивость к двум антибиотикам: тетрациклину и ампицилину. Вставка ДНК интерферона инактивирует ген, ответственный за устойчивость к ампицилину, поэтому первичный отбор клеток, получивших гибридные плазмиды, шел по устойчивости к тетрациклину.

Для отбора нужных клонов использовали следующий метод: смесь нескольких плазмид из разных клонов, одна из которых может содержать ДНК интерферона, денатурируют и связывают с твердой подложкой. С этой ДНК гибридизируют образцы РНК, полученные из продуцирующих ИФН клеток человека, фильтры промывают, элюируют РНК в денатурирующих условиях и элюат инъекцируют в овоциты африканской зеленой лягушки для выявления мРНК интерферона. Среди гибридизирующихся клонов выбран один, названный Hif-2h, имеющий вставку соответствующую размеру полного гена a- ИФН.

Клетки кишечной палочки, содержащие гибридные плазмиды, несущие такую вставку способны синтезировать полипептид с биологической активностью интерферона.

Работы по клонированию генов интерферона были повторены и развиты как названными выше авторами, так и другими группами исследователей во многих странах. В СССР первое успешное клонирование гена лейкоцитарного интерферона описано в 1982г. акад. Овчинниковым, фибробластного в 1983 г. -Ю.И. Козловым, иммунного - в 1985 г. Е.Д. Свердловым.

В настоящее время экспрессия генов ИФН произведена не только в клетки кишечной палочки, но и в клетки других грамотрицательных бактерий (Pseudomonas) - лежит в основе промышленного производства ИФН в России. В настоящее время считается, что наиболее эффективно использование для этих целей дрожжей.

Дрожжи рода Saccharomyces не патогенны для человека, имеют многовековой опыт их использования. Дрожжи не подвержены лизису, автолизу, легко сепарируются, используют дешевые субстраты. Биомасса дрожжей не содержит токсичных и пирогенных факторов, как клетки грамотрицательных бактерий.

Весьма важным обстоятельством является также сходство секреторных механизмов дрожжей и высших эукариот, это позволяет предположить, что клонированные гены преинтерферонов смогут давать зрелый ИФН в результате правильного процессинга.

Отработана технология массового культивирования клеток-продуцентов рекомбинантного ИФН. Так, для отечественного препарата реаферона она включает:

· культивирование бактериального штамма-продуцента реаферона в ферментерах объемом 100 л с выходом 5-7x103 ME из 1 л культуральной жидкости,

· разрушение биомассы методом, позволяющим увеличить процесс с 60-70 %-ным выходом целевого продукта,

· предварительную очистку реаферона на ионнообменнике; окончательную очистку препарата проводят на иммуносорбенте с моноклональными антителами к лейкоцитарному ИФН-а типа 5АС.

Основным продуцентом рекомбинантного ИФН являются бактериальные штаммы, в цитоплазме, которых синтезируется ИФН и составляет лишь доли процента от общей массы бактериальных белков. После накопления в специальных ферментерах достаточно высокой концентрации клеток их удаляют из ферментера и разрушают (лизируют). В качестве основных методов лизиса используют: осмотический шок, замораживание-оттаивание, гомогенизирование, обработку детергентами. Затем с помощью последовательных процедур фильтрования, центрифугирования, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии происходит предварительная очистка ИФН, дающая в итоге прозрачный бактериальный экстракт, в котором ИФН все еще составляет не более 1-2% от общего количества белка. Окончательную очистку препарата на иммуносорбенте с моноклональными антителами к ИФН.

Моноклональные антитела к ИФН «пришивают» к гранулам носителя и помещают в хроматографическую колонку. Затем наносят на колонку бактериальный экстракт, содержащий рекомбинантный ИФН. С антителами связывается лишь ИФН, другие же компоненты экстракта, в том числе все бактериальные токсины, свободно проходят через колонку и удаляются промывным раствором. Для извлечения из колонки адсорбировавшийся на антителах рекомбинантный ИФН через нее пропускают элюирующий буферный раствор, имеющий слабокислую реакцию. При этом связь между молекулами ИФН и антителами нарушается. ИФН переходит с поверхности частиц сефарозы в буферный раствор и может быть собран в виде чистого вещества, не содержащего загрязняющих белков.

Стремительное расширение использования рекомбинантных ИФН и параллельное сокращение в последнее время применения природных препаратов связано, главным образом, с дефицитом сырья для производства последних (донорская кровь), а также с распросранением вирусных заболеваний, передающихся через кровь (ВИЧ, гепатит С). В связи с чем, несмотря на наличие некоторых преимуществ препаратов природных ИФН, в клинике используются практически только рекомбинантные препараты.

Семейство ИФН-а содержит около 20 подтипов, поэтому природные препараты - Человеческий лейкоцитарный интерферон, Эгиферон, Вэлферон многокомпонентны и содержат все или, по крайней мере, большинство из подтипов. Природные ИФН не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном многократном введении. Некоторые рекомбинантные ИФН, напротив, при введении инъекционным путем могут вызвать образование нейтрализующих или связывающих антител.

Наиболее часто используются постые (непегилированные) и пегилированные альфа- и бета-ИФН. Например рекомбинантные ИФН-a2а (Реаферон, Роферон, Пегасис), рекомбинантные ИФН-a2b (Интрон А, Реальдирон, Пег-Интрон), являющиеся аналогами природных подтипов с точечными мутациями в белковой структуре lis-his, arg-his, arg-arg, соответственно, которые мало влияют на активность, но существенны с точки зрения сенсибилизации. Так препараты ИФН-a2а, не являющиеся характерными для человеческой популяции, имеют большой риск вызвать сенсибилизацию и образование антител, которые в высоких титрах будут снижать их терапевтический потенциал.

Иммунный интерферон (гамма-ИФН) может рассматриваться в качестве компонента лекарственных средств, предназначенных для лечения вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваний. За рубежом создан ряд препаратов на его основе: Иммунерон (США), Иммуномакс (Япония), Имукин (Германия). В России разработана эффективная схема получения высокоочищенного Дельтаферона, основанная на двух последовательных хроматографиях на одном сорбенте, но при разных значениях рН. Данная схема позволяет получать рекомбинантный Дельтаферон в препаративных количествах с допустимым содержанием высокополимерных примесей. Изменения в белковой молекуле (укорочение молекулы на 10 аминокислот и 3 аминокислотные замены) привели к 20-кратной потере антивирусной активности по сравнению с полноразмерным ИФН-γ, но не сказались на его иммуномодулирующих свойствах. В результате данной модификации у дельтаферона появилась устойчивость к протеолитическим ферментам. Разработаны экспериментальные лекарственные формы дельтаферона, которые позволяют сохранять белок в нативном состоянии без потери специфической активности. ЛФ дельтаферона обладают присущими исходному гамма-интерферону иммуномодулирующими свойствами.

С фармакологической точки зрения препараты ИФН должны рассматриваться, прежде всего, как иммуномодуляторы, оказывающие воздействие на функциональную активность эффекторных клеток иммунной системы и прежде всего Т-лимфоцитов и моноцитов (макрофагов). Под действием ИФН повышается эффективность иммунного распознавания антигена и усиливаются фагоцитарная и цитолитическая функции, направленные на элиминацию возбудителя или антигенно-измененных клеток. Интерферон циркулирует в организме около 2-х недель, что следует учитывать при применении его как профилактического средства.

Многолетний опыт показал, что при интраназальном введении ИФН обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении различных вирусов гриппа и парагриппа. Защитное действие наиболее выражено при ежедневном применении препарата с помощью ингаляторов или распылителей. Многократные интраназальные инсталляции или ингаляционное введение раствора препарата через нос и рот в форме аэрозоля в течение первых двух дней болезни приводило к более быстрому снижению явлений интоксикации и лихорадочной реакции. Быстрее уменьшались и выраженность воспалительных явлений в верхних дыхательных путях. Исследования последних лет показали, что ИФН подавляет размножение опухолевых клеток, что делает его эффективным при лечении опухолевых заболеваний. Противоопухолевое действие ИФН можно объяснить стимуляцией естественных защитных механизмов организма, в частности на лимфоциты, которые убивают раковые клетки или образуют антитела.

К настоящему времени определен круг заболеваний, при которых эффективно использование ИФН. Из вирусных инфекций - это ОРВИ, грипп, энцефалиты, вирусные гепатиты, герпетические поражения глаз (конъюнктивиты, кератоконъюктивиты), слизистых оболочек и глаз. По мнению клиницистов при герпетических поражениях кожи и слизистых оболочек следует отдавать предпочтение местному применению препарата. ИФН нашел применение при пересадках органов как средство, предупреждающее вторичные вирусные инфекции. Краткий анализ позволяет заключить, что ИФН способен положительно влиять на развитие самых различных заболеваний вирусной этиологии. Его эффективность наиболее выражена при острых инфекциях, на ранних сроках заболевания. При клиническом использовании следует отдавать предпочтение местному введению, обеспечивающему минимальный расход препарата. Кроме того, местное применение позволяет избежать отрицательных явлений, наблюдающихся при системном введении высоких доз ИФН.

Каждая лекарственная форма имеет свою область применения, обусловленную ее иммунобиологическими и фармакологическими свойствами. Это положение формулируется следующим образом:

Препараты ИФН не должны вызывать явлений сенсибилизации при длительном многократном применении прерывистыми курсами. Биосинтез ИФН для приготовления различных лекарственных форм может проводиться по единой технологической схеме, но способы очистки ИФН и ее критерии должны отвечать задачам терапии. В инъекционных лекарственных формах примеси, антигенные для человека, должны отсутствовать. Их уровень в препаратах для местного пользования должен быть ниже порога сенсибилизации.

Теоретически в природных препаратах ИФН-a могут присутствовать 3 основные группы антигенов:

· антигены вируса-индуктора и куриной аллантоисной жидкости;

· эритроцитарные антигены, определяющие группу крови и резус-принадлежность;

· лейкоцитарные антигены HLA.

Биотехнология получения ИФН должна включать операции, ограничивающие возможность проникновения этих антигенов в лекарственные формы. Технологически наиболее трудной задачей является удаление анитигенов I группы, так как на стадии индукции их вводят в суспензию в большом количестве.

Препараты природного ИФН-a в зависимости от методов очистки можно разделить на две группы - нативные и концентрированные. Препараты нативного типа по белковому составу практически не отличается от исходных полуфабрикатов, характеризуются невысокой удельной активностью - до 1-104 ME на 1 мг белка, но сохраняют все цитокины, продуцированные в процессе интерфероногенеза, в их естественном соотношении. Поэтому они обладают высоким потенциалом иммунобиологического действия.

Биотехнология получения концентрированных препаратов включает химическую очистку, что приводит к снижению потенциала иммунобиологического действия из-за утраты цитокинов. Однако эти препараты представляют также ценность для практического здравоохранения. Например, высококонцентрированный человеческий лейкоцитарный ИФН – ЧЛИ для инъекций –пока незаменим в ситуациях, когда необходимо ввести высокие разовые дозы (лимфобластный лейкоз в стадии обострения), а также при лечении вирусных и онкологических поражений, локализованных за гематоэнцефалическим барьером. К препаратам концентрированного типа относится и интерлок, который успешно применяют для местного лечения вирусных поражений глаз.

Третью группу составляют рекомбинантные ИФН, представленные реафероном и реальдоном. При многих формах патологии препараты для местного применения (интраназальные капли, мазь, ректальные суппозитории, глазные пленки и др.) более эффективны, чем инъекционные. Например, при активном хроническом ВГВ использование ректальных суппозиториев, содержащих всего 100 000 ME ИФН-а, дает такие же результаты, как и внутримышечное введение высококонцентрированного препарата в дозе 3 ME. Расход препарата и стоимость лечения при применении ректальных суппозиториев снижается в десятки раз.

Современные рекомбинантные препараты ИФН:

Реаферон (человеческий рекомбинантный ИФН-а2) производство НПО «Вектор» г. Новосибирск.

· получен при культивировании бактериального штамма Pseudomonas sporogenosa, содержащего в своем генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена ИФН-а2 человека.

· предназначен для внутримышечного, субконъюнктиванного и местного применения.

Выпускается в виде лиофилизированного порошка в ампулах.

Интрон А (человеческий рекомбинантный ИФН-a2b) фирмы Schering Plough -США.

Препарат получен по рекомбинантной ДНК-технологии с использованием бактериальных E.coli, содержащих встроенный генно-инженерным путем ген, кодирующий этот человеческий белок.

Спецификация активности 2*108 МЕ/мг белка.

Введение больших доз белка сопровождается повышением температуры, появлением головной боли, расстройством желудочно-кишечного тракта (тошнота, иногда обострение гепатита), возникают нарушения в работе сердечно-сосудистой системы.

На основании изучения онтогенеза системы ИФН разработан новый отечественный препарат виферон-суппозитории, включающие в себя рекомби-нантный ИФН-а, и препараты антиоксидантного действия. Виферон положительно зарекомендовал себя при лечении вирусных и бактериальных заболеваний у новорожденных детей: внутриутробный герпес, хламидиоз, ОРВИ, кандидоз

Пегилированные интерфероны

Противовирусная терапия - одна из основных областей перспективного использования пегилированных препаратов пептидной структуры. Ярким примером использования концепции пегилирования биотехнологических препаратов является создание пегилированных интерферонов (пег-ИФН). К клинической практике, в настоящее время, применяются пегилированные аналоги альфа-интерферона - ПЭГ-интерферона-альфа 2b (Пегинтрон; Shering Plough) и ПЭГ-интерферона-альфа 2а (Пегасис; Hoffmann La Roche).

интерферон лейкоцит ген вирус

В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию .

В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.

Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli .

Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN, штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041) .

Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.

Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии .

Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона.

Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.

Пример получения рекомбинантного интерферона:

600 г биомассы клеток Pseudomonas putida 84,содержавших рекомбинантную плазмиду p VG-3, после культивирования содержали 130 мг альфа-2 интерферона. Клетки загружали в емкость баллистического дезинтегратора с механической мешалкой вместимостью 5,0 л и приливали к ней 3,0 л лизисного буфера, содержащего 1,2% хлористого натрия, 1,2% трис-(гидроксиметил)-аминометана, 10% сахарозы, 0,15% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,02% фенилметилсульфонилфторида и 0,01% дитиотреитола при рН 7,7. Биомассу перемешивали до получения однородной суспензии в течение 30 мин, затем дезинтегрировали в циркуляционном режиме в баллистическом дезинтеграторе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Время дезинтеграции составляло 1,5 ч. Процесс дезинтеграции заканчивали, когда при микроскопировании препарата в нескольких полях зрения микроскопа практически не наблюдается целых клеток микроорганизмов. Объем суспензии лизированной биомассы составил 3,5 л.

Полученный на данной стадии лизат затем поступал на стадию осаждения нуклеиновых кислот. Для этого в емкость, содержащую лизат при перемешивании со скоростью 1-1,2 л/ч подавали 180 мл 5% раствора полиэтиленимина. Суспензию перемешивали в течение 1 ч и центрифугировали для отделения осадка нуклеиновых кислот 1 ч при (9500±500) об/мин, при температуре (5±2)С. После центрифугирования отделяли супернатант, объем которого составлял 3,0 л .

При медленном перемешивании мешалкой в супернатант всыпали 182 г сухого сульфата аммония малыми порциями (каждую следующую порцию добавляли после полного растворения предыдущей). После окончания внесения сульфата аммония перемешивание продолжали до полного растворения соли и суспензию осадка белков выдерживали при температуре (5±2)С 16 ч, а затем центрифугировали в течение 1 ч при (13500±500) об/мин при температуре (5±2)С.

Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде, доводя общий объем до 4 л. Для осаждения сопутствующих белков проводили кислотное фракционирование полученного раствора, содержащего альфа-2 интерферон. Для этого в раствор добавляли 5,0 мл 50%-ной уксусной кислоты до рН 4,75. Полученную смесь переносили в холодильник и оставляли при температуре (5±2)С в течение 3 ч, затем центрифугировали суспензию белков при (13500±500) об/мин 30 мин при (5±2)С.

К 4 л супернатанта добавляли 50,0 мл 1 М раствора Триса до рН (6,9±0,1). Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляла 9,0 мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (6,80,5)106 МЕ/мл. Удельная активность 8,5105 МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии 2,91010 ME.

Сорбент Солоза КГ в количестве 0,6 л в виде водной взвеси помещали в хроматографическую колонку. Затем с помощью перистальтического насоса через сорбент последовательно пропускали 2,0 л 0,2 М раствора гидроокиси натрия, 6,0 л дистиллированной воды и 4,5 л 0,05 М трис-ацетатного буферного раствора при рН (7,1±0,1), который на выходе из колонки контролировали рН-метром.

Раствор белков, содержащий альфа-2 интерферон, разбавляли дистиллированной водой до проводимости (6,0+2,0) мСм/см при комнатной температуре. Объем раствора при этом составил 19,2 л.

Раствор наносили на колонку со скоростью 1,5 л/час, затем промывали сорбент 2,0 л трис-ацетатного буфера 0,05 М при рН 7,0. Элюцию проводили 1,2 л 0,05 М раствором Триса с рН (10,2±0,1) Содержание интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора фракций, определяли иммуноферментным методом.

Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляет (2,2±0,2) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (2,1±0,5)107 МЕ/мл, удельная активность препарата (9,7±0,5)106 МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии составляет (1,5±0,5)1010 ME.

Сорбент Сфероцелл qae в количестве 0,15 л в виде водной суспензии загружали в колонку и промывали со скоростью 0,15 л/ч последовательно 0,5 л 2 М раствора хлористого натрия, 1,5 л дистиллированной воды и 1,0 л трис-ацетатного буферного раствора 0,05 М с рН 8,0, контролируя рН буферного раствора на выходе из колонки рН-метром .

Раствор белков объемом 0,7 л, содержащий альфа-2 интерферон наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл-QAE объемом 0,15 л со скоростью 0,2 л/час. Промывку колонки осуществляли трис-ацетатным 0,05 М буферным раствором (рН 8,0) объемом 0,1 л, затем примесные белки отмывали 1,0 л того же буферного раствора с добавлением 0,05 М NaCI. Элюцию интерферона проводили 0,8 л 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. Содержание альфа-2 интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора определяли иммуноферментным методом. Концентрация белка составляла (0,35±0,05) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (1,7±0,2)107 МЕ/мл. Удельная активность препарата 5,5107 МЕ/мг белка. Элюат содержал 1,20х1010 ME. Выход по биологической активности на данной стадии 82,5%.

Полученный раствор доводили до рН (5,0±0,1) 50% уксусной кислотой и разбавляли 0,05 М натрий-ацетатным буферным раствором. Удельная электропроводность составила (0,29±0,02) мСм/см при температуре (5±2)С. Подготовленный таким образом раствор белка наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл ЛП-М со скоростью 0,1 л/ч, промывали 0,3 л вышеуказанного буферного раствора, а затем элюировали интерферон с помощью линейного градиента концентрации хлористого натрия, создаваемой с помощью градиентного смесителя Ультроград Элюат фракционировали с помощью коллектора фракций и измеряли концентрацию общего белка и альфа-2 интерферона. Концентрация белка в объединенных фракциях (0,45±0,02) мг/мл. Объем раствора 0,1 л. Общее содержание альфа-2 интерферона (8,6±0,2)109 ME. Удельная активность - е (7,5±0,2)107 МЕ/мг. Выход на данной стадии 73%.

Полученный 3 раствор объемом 0,1 л концентрировали до (5,0±0,2) мл с помощью ячейки для ультрафильтрации, используя мембрану Amicon YM-3. Подготовленный таким образом образец наносили на колонку с сорбентом Сефадекс G-100, уравновешенную фосфатно-солевым буфером со скоростью 0,025 л/ч. Объем фракций составляет 10,0 мл. Полученные после хроматографии фракции проверяли на содержание альфа-2 интерферона иммуноферментным методом и объединяя фракции, содержащие основной пик альфа-2 интерферона. Объем полученного раствора составил 30,2 мл. Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, (0,90±0,02) мг/мл. Общее содержание альфа-2 интерферона в растворе 5,5109 ME. Удельная активность полученного препарата альфа-2 интерферона 2,3108 МЕ/мг. Выход по альфа-2 интерферону на данной стадии составляет 90,2%. Полученный продукт стерилизовали и расфасовывали. Общий выход препарата 35,8%, в том числе на стадии очистки 51% .

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка .

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

1) Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.

2) Полученным продуктом трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.

3) Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - мРНК.

4) Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка.

5) Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК человека .

Похожая информация.

Тема: Интерфероны. Получение интерферонов.

Интерфероны были открыты в 1957 году в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать здоровым клеткам устойчивость к вирусной инфекции: он как бы препятствовал (интерферировал) размножению вирусов в клетке и в силу этой способности был назван интерфероном. Существует три разновидности интерферонов:

α, β, относимые к первому классу, γ-интерферон, относимый к второму классу.

Интерферон-α, продуцируемый лейкоцитами, обладает преимущественно противовирусным, антипролиферативным и противоопухолевым действием.

Интерферон-β, образуемый фибробластами, обладает преимущественно противоопухолевым, а также антивирусным действием.

Интерферон –γ – продуцируются Т-лимфоцитами и естественными киллерами (NΚ-клетками) и называется лимфоцитарным и иммунным. Он обладает преимущественно иммуномодулирующим и слабым противовирусным эффектом.

Продукцию интерферонов Ι класса индуцируют вирусы, двухцепочечные РНК, синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды,продукцию интерферона – γ – вирусные и бактериальные антигены или антисыворотки против поверхностных детерминант лимфоцитов.Противовирусный эффект интерферонов обусловлен способностью активировать в клетках синтез двух ферментов – олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы, ингибирующих биосинтез белка и размножение вируса в инфицированной клетке, что вызывает ее лизис. Таков же механизм антипролиферативного противоопухолевого действия интерферонов.

Интерферон-γ – полифункциональный иммуномодулирующий лимфокин, влияющий на рост и дифференцировку клеток разных типов. Он активирует макрофаги на этапе передачи антигенной информации лимфоциту, повышает их антимикробную и противоопухолевую активность, продукцию ИЛ-1. ИФ-γ активирует естественные киллеры, цитотоксические лимфоциты, подавляющие рост опухолей.

Интерфероны-α являются протеинами, а β и γ – интерфероны – гликопротеинами, они представляют собой типичные глобулярные белки. В α – интерферонах обнаружены две дисульфидные связи. Интерфероны – низкомолекулярные белки из 146-166 аминокислотных остатков, видоспецифичны, т.е. человеческий интерферон биологически активен в организме человека, мышиный – только в организме мыши.

К числу наиболее хорошо исследованных интерферонов относятся α-интерфероны; число генов, их кодирующих примерно 20, они локализованы в 9-й хромосоме. В отношении β-интерферонов – выделен только один белок, соответствующий β-интерферону человека – интерферон β 1 – ему соответствует практически вся противовирусная активность. Не исключено, что в геноме существует ряд генов, кодирующих различные β – интерфероны. Гены β – интерферонов локализованы в 9-й хромосоме. Интерферон-γ представлен всего одним индивидуальным белком, который кодируется одним геном, расположенным в 12-й хромосоме.

Получение интерферонов . Интерфероны служат одним из самых эффективных средств лечения вирусных инфекций, но они видоспецифичны и могут быть получены только из клеток человека. Технология выделения и очистки интерферонов малоэффективна, прежде всего, из-за крайне малого выхода конечного продукта (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т.е. примерно одну дозу для инъекции).

На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. кДНК полученные обратным транскрибированием, были клонированы в E.coli. Ген интерферона был встроен в векторную ДНК, и к нему были присоединены бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке. Сначала интерфероны в клетке синтезируются в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется, и в результате чего образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Поэтому для того, чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Данная процедура осуществлялась следующим образом. Ген интерферона содержит три участка расщепления рестриктазой Sau 3А1, из которых один находится рядом с сигнальной частью. Неполное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон, но без первого цистеина. Триплет АТG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью. Для восстановления полинуклеотидной последовательности полного гена химически был синтезирован небольшой фрагмент ДНК, содержащий данный триплет, а также примыкающий к нему триплет АТG – точка инициации синтеза белка. Этот фрагмент присоединили к изолированной части зрелого гена, и в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона. Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обеспечивающий начало синтеза мРНК. Экстракты из E.coli, содержащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью. Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен и его физико-химические свойства оказались близкими свойствами интерферона, полученного из крови доноров. Удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1л бактериальной суспензии, содержащей примерно 1011 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1л крови доноров.

При использовании генно-инженерных технологий в разных лабораториях были получены штаммы бактерий, продуцирующих различные интерфероны: α-, β- и γ- типов. Недостаток использования E.coli для получения β- и γ-интерферонов – отсутствие в бактерии аппарата гликолизирования эукариотических белков, что приводит к синтезу негликолизированных молекул. И хотя роль гликолизирования неясна и негликолизированные β- и γ-интерфероны практически полностью сохраняют противовирусную активность, эта особенность диктует осторожный подход к использованию генно-инженерных препаратов в медицинской практике.

В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликолизирование. В 1981 году в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерферона человека были употреблены генетически сконструированные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученная эффективная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрожжей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз.

Интерфероны выпускают в качестве лекарственных препаратов в виде каплей в нос, мазей и растворов для инъекций. Существуют натуральные интерфероны, полученные из лимфоцитов донорской крови и искусственно синтезированные с применением генно-инженерных технологий (рекомбинантные). В настоящее время в России и за рубежом выпускают коммерческие препараты – человеческий лейкоцитарный, лимфобластный (Велферон) и фибробластный (Ферон), а также интерфероны, полученные генно-инженерными методами: рекомбинантные α-интерферон (Роферон, Реальдерон и др.), β-интерферон и γ-интерферон (Гаммаферон).

Самыми первыми, кто всерьёз заинтересовался генной инженерией , были фармацевтические фирмы. Они быстро поняли, что, благодаря новым технологиям, можно получать практически любые белки и в больших количествах.

Что такое белок? Это рабочая молекула клетки. Она играет огромную роль в регуляции тех процессов, которые идут в организме. Почти все гормоны представляют собой небольшие белковые молекулы. Они содержат несколько десятков аминокислотных остатков.

До генной инженерии производство гормонов было чрезвычайно сложным делом. Людям просто повезло с инсулином, так как он являлся животным белком, взятым у свиньи или крупного рогатого скота, и мог служить заменой гормона человека. Но в большинстве случаев такое просто невозможно. А вот, благодаря генной инженерии, за короткий срок были получены штаммы бактерий, способные вырабатывать самые разнообразные человеческие гормоны.

Для примера можно рассмотреть гормон роста. Организм может его не вырабатывать в результате генетического дефекта. В этом случае человек становится карликом. Чтобы такое предотвратить, ребёнку необходимо вводить этот важнейший гормон. В прежние времена получить его можно было лишь из человеческих трупов. В наше же время он широко производится в лабораторных условиях.

Что же касается уже упомянутого инсулина, то он нужен в первую очередь людям, страдающим сахарным диабетом. Этот недуг распространён достаточно широко. Те, кто им страдает, в основной массе обходится животным инсулином. Но у отдельных больных он вызывает аллергию. Им нужен не животный, а человеческий инсулин. На сегодняшний день этот вопрос решён.

Интерферон

Большим достижением стала возможность получения человеческого интерферона. Интерферон - белок, который обладает чрезвычайно эффективным антивирусным действием. Самое же главное - его универсальность. Этот белок эффективен против самых разнообразных вирусов. По своей сути он является точно таким же средством для вирусов, как антибиотики для бактерий. Но есть одно важное отличие.

Антибиотик подавляет бактерию лишь в том случае, если у неё нет гена устойчивости. А для интерферона характерна видовая специфика. В человеческом организме подавлять вирусную инфекцию способен лишь человеческий интерферон, в некоторых случаях можно использовать обезьяний.

Но до недавнего времени наладить получение человеческого интерферона не удавалось. Специалисты не могли даже определить аминокислотную последовательность этого белка. Однако генно-инженерная фармакология, практически, в течение года кардинально всё изменила.

Получение интерферона

Из клеток крови, заражённых вирусной инфекцией, выделили интерфероновую мРНК. С помощью ревертазы (фермент, ведущий синтез ДНК по матрице РНК) синтезировали ген интерферона и внедрили его в плазмиду . Так был получен бактериальный штамм, способный вырабатывать искусственный интерферон. По нему определили аминокислотную последовательность. А уже по ней построили нуклеотидную последовательность гена, который был синтезирован. Его также встроили в плазмиду, и получился ещё один штамм, вырабатывающий нужный белок.

Что касается искусственного интерферона, то он оказался чрезвычайно эффективным противовирусным средством. Был осуществлён следующий опыт. Взяли 8 обезьян и разделили их на 2 группы. Всем животным ввели вирус энцефаломиокардита. К этому вирусу у животных иммунитета не было. Поэтому они были обречены на смерть.

Одна контрольная группа животных погибла по прошествию нескольких дней после заражения. А второй группе за несколько часов до заражения и затем несколько раз после заражения вводили искусственный интерферон. Все 4 обезьяны остались живы. В настоящее время данным препаратом лечат вирусные заболевания, гепатит и венерические болезни, вызываемые папилломой.

Вакцинация

Вакцинация - чрезвычайно эффективное средство по предупреждению вирусных эпидемий. Как правило, для вакцинации используются убитые вирусы. У них выведены из строя РНК, а вот белки сохранены. Убитые вирусы попадают в организм, а тот вырабатывает антитела. Если в дальнейшем в организм смогут попасть живые вирусы, то иммунная система их узнает и убьёт выработанными антителами.

Благодаря вакцинации, были ликвидированы такие страшные инфекции как оспа и чума. В Средние века от них умирали миллионы людей. Однако существуют вирусы, от которых не удаётся избавиться. Сюда можно отнести ВИЧ, вирус гриппа, а для животных вирус ящура. В данных случаях вакцинация либо вообще ничего не даёт, либо приводит к частичному успеху.

Причина заключается в изменчивости вирусов. Это означает, что в их белках происходят замены аминокислот, и эти вирусы становятся неузнаваемыми для иммунной системы человека. Соответственно, каждый год приходится проводить новую вакцинацию. Однако это чревато негативными факторами.

Когда вакцинацию проводят в огромных масштабах, то трудно гарантировать, что все вводимые в организм вирусные частицы убиты. Поэтому есть вероятность, что такое мероприятие может обернуться не спасением, а эпидемией.

А вот посредством генно-инженерной фармакологии можно получить идеальную безвредную вакцину. Для этого бактерию заставляют вырабатывать белок оболочки вируса. В этом случае вакцина вообще не содержит в себе инфицированных РНК, поэтому она уже изначально не может возбудить болезнь. А вот пробудить иммунитет может.

Такая вакцина была получена и опробована. Специалисты провели опыты с белком оболочки вируса ящура. Испытания дали определённые позитивные результаты, но не такие эффективные, как ожидалось вначале. Иммунизация такой вакцины в 1000 раз хуже, чем если использовать убитый вирус.

Вакцина против оспы

Рассматривая вопрос производства вакцин, нельзя не сказать об использовании живой вакцины против оспы. Эта история по праву заслуживает всяческого уважения. Началась она в то время, когда оспа свирепствовала на территории Европы и уносила миллионы жизней.

В то время все врачи искали средство, способное победить страшное заболевание. В 1798 году это удалось английскому врачу Эдварду Дженнеру. Он обратил внимание на тот факт, что доярки иногда заражались от коров лёгкой формой оспы. Данное заболевание было не смертельным, и женщины выздоравливали. Но зато в дальнейшем они уже не болели той оспой, от которой гибли люди.

Эдвард Дженнер начал специально заражать людей коровьей оспой. И таким образом защитил их от настоящей смертельной оспы. Так английский врач положил начало вакцинации (латинское слово vaccinus - коровья).

Коровий и человеческий вирус оспы разные, но у них много общего. Но самое главное то, что отдельные белки на поверхности коровьего вируса, который получил название вируса осповакцины, абсолютно схожи с аналогичными белками на поверхности человеческого вируса. Вот поэтому иммунная система, приведённая в боевую готовность в результате прививки вируса осповакцины, прекрасно защищает организм и от смертельного вируса оспы.

Следует заметить, что осповакцина оказалась уникальным средством для эпидемиологии. Данный вирус для человека абсолютно безвреден и чрезвычайно эффективен. В 1977 году ВОЗ объявила, что с оспой на планете покончено. А ведь она уносила десятки миллионов человеческих жизней.

Но надобность в вакцине против оспы не пропала. Сотрудники Института здравоохранения США решили посредством генно-инженерной фармакологии изменить эффективный вирус так, чтобы он защищал не только от оспы, но ещё и от гепатита.

В молекулу ДНК вируса осповакцины был встроен ген поверхностного белка вируса гепатита. При этом он был снабжён эффективным промотором (часть ДНК, с которой связывается РНК-полимераза для начала синтеза мРНК). После этого провели опыты на кроликах. Они показали, что при вакцинации таким вирусом в крови вырабатывается белок гепатита, но тут же в ответ появляются антитела, способные противостоять этому заболеванию.