Клеточная селекция. Биотехнология в растениеводстве
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ
Лекция 9
Дополнительная
Основная
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Вопросы для самоконтроля
1) Что такое метанообразование?
2) Сколько фаз в механизме метанообразования?
3) Из чего состоит биогаз?
4) Какие типы биогазовых установок существуют?
1) Волова, Т.Г. Экологическая биотехнология: уч. пособие для университетов / Т.Г. Волова. - Новосибирск: Хронограф, 2007. – 141с.
1) Елинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Елинов. - СПб.: Наука, 1995, 600с.
2) Биотехнология / Под ред. А. А. Баева. – М: Наука, 1984. – 309с.
3) Сельскохозяйственная биотехнология / под. ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высшая школа, 2003. – 469 с.
Повышение биологической продуктивности в сельском хозяйстве является предметом активных исследований комплекса различных биологических наук. Биотехнологические методы традиционно используются в сельском хозяйстве для повышения плодородия почв, борьбы с вредителями и возбудителями болезней культурных растений и животных, приготовления продовольственных продуктов, их консервирования и улучшения питательных свойств. При этом удельный вес биотехнологии для развития и повышения эффективности традиционных сельскохозяйственных технологий постоянно возрастает.
В настоящее время особые перспективы в создании и распространении новых культивируемых сортов растений обещает применение новейших методов биотехнологии – клеточной и генетической инженерии. Усилия биотехнологов направлены на увеличение выхода продукции и повышение ее питательности, усиление устойчивости культивируемых биологических видов к неблагоприятным условиям внешней среды, патогенам и вредителям. При этом остается актуальной проблема поддержания разнообразия среди культивируемых видов и сохранения генетических ресурсов в целом.
Микроорганизмы играют большую роль в повышении плодородия почвы, так как в процессе роста и развития улучшают ее структуру, обогащают питательными веществами, способствуют более полному использованию удобрений.
Интенсивное растениеводство обедняет почву азотом, так как значительная его доля ежегодно выносится из почвы вместе с урожаем. С древних времен для восстановления и улучшения почв существует практика использования бобовых растений, способных в симбиозе с азотфиксирующими микроорганизмами восполнять почвенные запасы азота в результате диазотрофности. Большой положительный эффект от возделывания бобовых вызвал постановку исследований явления диазотрофности. Культивирование бобовых положительно влияет на азотный баланс почв, также облегчает борьбу с эрозией и помогает восстанавливать истощенные земли.
Технология получения азотных биоудобрений. Наиболее простой способ инокуляции основан на использовании почвы после выращивания на ней бобовых растений. Этот метод разработан в конце XIX века и применяется до настоящего времени. Недостаток метода – необходимость перемещения достаточно больших объемов почвы (100–1000 кг/га), а также возможность распространения болезней.
Более эффективным оказалось применение для инокуляции семян специальных препаратов азотфиксирующих бактерий. Клубеньковые бактерии рода Rhizobium, развиваясь в корневой системе бобовых растений, в симбиозе с ними фиксируют атмосферный азот, обеспечивая этим азотное питание растений. Процесс азотфиксации протекает только в клубеньках на корнях бобовых растений, которые образуются в результате проникновения бактерий через корневые волоски в корень. Взаимоотношение бактерий с растениями зависит от комплекса условий, включая физиологическое состояние и условия роста растений, а также физиологическую активность и вирулентность бактерий. Под вирулентностью понимают способность бактерий проникать внутрь корня растений и вызывать образование клубенька.
Первая коммерческая разновидность культуры для инокуляции семян (товарное название «Nitragin») была запатентована в Великобритании Ноббе и Хилтнером в 1896 году. Для разных бобовых в то время выпускали 17 вариантов культуры. В 20-е годы выпускалось много разновидностей инокулятов, среди них были чистые культуры азотфиксирующих микроорганизмов, смеси бактерий с песком или торфом, а также культуры, выращенные на агаре или в жидкой среде.
В качестве носителя для бактерий были опробованы различные композиции: смеси торфа с почвой, добавки люцерны и соломы, перегнившие опилки, бентоит и активированный уголь. В настоящее время для поддержания жизнеспособности симбиотических азотфиксирующих бактерий используют разнообразные носители, но лучшим считается торф.
Сухие препараты азотфиксаторов, приготовленные на основе клубеньковых бактерий рода Rhizobium и предназначенные для повышения урожайности бобовых растений (гороха, фасоли, сои, клевера, люцерны, люпина и др.) в настоящее время выпускаются под товарным названием «Нитрагин». Помимо почвенного нитрагина, выпускают также сухой нитрагин – препарат бактерий с содержанием в 1г не менее 9 млрд. жизнеспособных клеток, в качестве наполнителя используют мел, каолин, бентоит. Препараты сухого нитрагина с остаточной влажностью 5–7 % фасуют по 0.2–1.0 кг и хранят при 15 °С в течение 6 месяцев.
Аналог азотных удобрений – другой препарат азотфиксирующих бактерий – «Азотобактерин», который выпускается промышленностью в нескольких вариантах. Бактерии рода Azotobacter являются свободноживущими азотфиксирующими микроорганизмами и обладают высокой продуктивностью азотфиксации (до 20 мг/г использованного сахара). Помимо связывания атмосферного азота, эти бактерии продуцируют биологически активные соединения (витамины, гиббериллин, гетероауксин и др.). В результате этого инокуляция азотобактерином стимулирует прорастание семян и ускоряет рост и развитие растений. Более того, Azotabacter способен экскретировать фунгицидные вещества. Этим угнетается развитие в ризосфере растений микроскопических грибов, многие из которых тормозят развитие растений. Однако бактерии рода Azotobacter весьма требовательны к условиям среды, особенно концентрации в почве фосфатов и микроэлементов, и активно развиваются в плодородных почвах.
В последние годы для изучения биологической азотфиксации стали применять методы молекулярной биологии и новейшие методы генетики.
Установлена возможность с помощью колифага P1 размножать свободноживущую азотфиксирующую бактерию Klebsiella pneumoniae М5 и с ее помощью трансдуцировать nif-гены (гены азотфиксации). Также доказано, что перенос nif-генов возможен с помощью плазмид от штамма-азотфиксатора к штамму, не обладающему диазотрофностью. Обнаружены конъюгативные плазмиды, несущие гены азотфиксации, относительно легко передающиеся при конъюгации от штамма к штамму. П осле этого появились надежды на получение методами клеточной и генной инженерии растений, способных фиксировать атмосферный азот. Однако перенос генов азотфиксации и их экспрессия является чрезвычайно сложной задачей.
Снабжение растений фосфатами. Фосфатные ионы в почве, как известно, не очень подвижны, поэтому вокруг корневой зоны растений часто возникает дефицит фосфора.
Для улучшения питания сельскохозяйственных культур фосфатами эффективен метод применения фосфоробактерина. Препарат получают на основе спор культуры Bacillus megaterium var. phosphaticum . Эти бактерии превращают трудно усвояемые минеральные фосфаты и фосфорорганические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды) в доступную для растений форму. Следует отметить, что фосфоробактерин не заменяет фосфорные удобрения и не действует без них. Положительный эффект от применения фосфоробактерина не только связан с доставкой усвояемых фосфатов к растениям, но обусловлен также действием биологически активных веществ (тиамина, биотина, никотиновой и пантотеновой кислот, витамина В12 и др.). Данные биологически активные вещества, попадая на поверхность семян при инокуляции, а затем в ткани растения, стимулируют фосфорное и азотное питание, то есть благоприятно действуют на развитие растений на первых этапах.
Большая часть медико-биологических исследований проводится на клетках in vitro (то есть, не на живом организме, а на клетках «в пробирке»). Клетки используют в качестве модельного биологического объекта в научных исследованиях, при тестировании и производстве лекарств. Кроме этого, ученые научились исправлять генетические ошибки в клетках и наделять их способностью противостоять некоторым заболеваниям, что служит основой для медицинских технологий будущего - генной и клеточной терапий. Эта статья расскажет о методах работы с клетками, а также о возможностях и ограничениях, связанных с их использованием.
Генеральный партнер цикла - компания : крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Партнер этой статьи -
Живой объект состоит из более мелких составных частей: органов, тканей, клеток, органелл, биомолекул и одновременно является частью более масштабных систем - таких как пищевые цепочки, экосистемы, сообщества. Еще Гиппократ и Аристотель задавались вопросом соотношения целого и его частей и сошлись в понимании, что целое есть больше, чем сумма частей. Однако современная наука почти полностью полагается на альтернативный принцип - редукционизм, - в соответствии с которым познание целого осуществляется через познание его составных частей. При таком подходе теряются связи между частями, в нашем случае - между клетками. Хотя каждая клетка есть тоже, по сути, целое, но вне организма это уже не совсем та клетка, что была в его составе. Что меняется при таком переходе?
Наглядной иллюстрацией служат слизевики . Эти одноклеточные обладают способностью объединяться из десятков тысяч клеток в плазмодий , который в поисках еды может быстро передвигаться и выбрасывать споры на большое расстояние, а потом вновь распадаться на отдельные клетки (видео 1). Многие бактерии тоже обладают способностью формировать плотные конгломераты - биофильмы, или биопленки, в которых внутренние клетки защищены внешними от окружающей среды. То есть объединение в многоклеточные структуры приводит к возникновению новых функций, отсутствующих у отдельных клеток. Конкурентные преимущества за счет приобретения новых способностей послужили причиной объединения одноклеточных организмов в многоклеточные около 1 млрд лет назад .
Видео 1. Dictyostelium discoideum - одноклеточный слизевик. Когда слизевики ищут еду, отдельные клетки объединяются и формируют плазмодий до 2 мм длиной.
В многоклеточных организмах клетки существуют в неразрывной связи друг с другом на протяжении сотен миллионов лет эволюции и за это время полностью перестроились на выполнение конкретных функций. Спектр экспрессируемых клеткой генов, ее функции и активность, форма и размер, скорость деления и гибель регулируются связями с другими клетками организма. У млекопитающих эта связь основана на всевозможных сигналах: химических (гормоны, цитокины, ростовые факторы, питательные вещества, производные кислорода, ионы металлов и др.), механических и электрических (передаваемых нейронами) (рис. 4).
Рисунок 4. Основные типы межклеточных взаимодействий. В составе организма клетки тесно связаны между собой, а их активность строго скоординирована. Для этого используются: электрические сигналы (сверху ), передаваемые нейронами, химические сигналы (посередине ), передаваемые через кровь (эндокринно) или межклеточную жидкость (паракринно), а также механические силы (снизу ). Эти связи существуют как между соседними клетками, так и между даже самыми удаленными клетками организма. Клетка преобразует поступающие сигналы в инструкции для изменения спектра активных генов, а следовательно, и свойств самой клетки.
Межклеточная коммуникация лежит в основе процессов, изучаемых почти всеми медицинскими дисциплинами, в частности эндокринологией, неврологией, кардиологией, гематологией и др., но о полной расшифровке этих взаимодействий пока говорить не приходится. Если у клетки в организме нарушаются нормальные связи с окружением, она либо умирает (для этого существуют специальные механизмы самоуничтожения - апоптоз и аноикис), либо становится «асоциальной», то есть раковой. При выделении из организма и переносе в чашку Петри клетки тоже теряют почти все внешние связи, но в благоприятных условиях некоторое время живут и делятся (однако могут стать и раковыми).
В новых, искусственных условиях клетки сохраняют лишь геном, а все остальные свойства меняются - размер, скорость роста, экспрессия генов, функциональная активность, чувствительность к лекарствам, метаболизм, состав мембран и другие. В связи с этим сегодня ведется активный поиск условий in vitro , которые максимально воспроизводят условия in vivo . Большинство тканей организма содержат несколько типов клеток, имеют сложную структуру внеклеточного матрикса и пронизаны сетью сосудов и нервов (рис. 5). Полностью воссоздать такую архитектуру in vitro пока невозможно, а значит, и клетки в культуре пока остаются лишь приближением к клеткам в составе организма.
Рисунок 5. Сложная организация соединительной ткани in vivo , состоящей из: нескольких типов клеток (фибробласты, жировые клетки, макрофаги и другие лейкоциты), нескольких типов волокон (1 - эластичные, 2 - ретикулярные и 3 - коллагеновые), нервов и сосудов, заключенных в гидрогель из полисахаридов.
Выделение и культивирование клеток
Источником клеток может быть любая ткань организма. В большинстве тканей клетки находятся внутри так называемого внеклеточного матрикса , который разделяет ткань на области и формирует ее архитектуру (рис. 5 и 6) . Внеклеточный матрикс состоит из белков, образующих фибриллы: коллагена, фибронектина, эластина и протеогликанов с длинными полисахаридными ветвями (гликозаминогликанами). Последние великолепно удерживают жидкость и формируют в бoльшей части внеклеточного пространства так называемый гидрогель. В случае кости матрикс формируется из кристаллизованного фосфата кальция . Самый распространенный из белков человека - коллаген: он составляет до 30% массы всех белков организма. Компоненты матрикса синтезируются многими клетками, но специализируются на этом фибробласты.
Рисунок 6. Как выглядят ткани под микроскопом: прижизненная мультифотонная микроскопия различных участков кожи, содержащих рыхлую (а ) и плотную (б ) соединительные ткани, мышечные (в ) и нервные волокна (г ), жировые клетки (д ) и микровезикулы (е ). Коллагеновые волокна изображены красным цветом (кроме в ), кровеносные сосуды - зеленым, клетки и микровезикулы - голубым (на б - зеленым). Шкала размера - 50 мкм. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.
Для выделения клеток необходимо разрушить внеклеточный матрикс и разорвать связи между клетками, после чего клетки «рассыпаются» (рис. 7). Клеточную культуру можно получить и другим способом: поместив в культуральную среду кусок ткани целиком, и тогда часть клеток постепенно выползет и засеет окружающее пространство. Такой тип культуры называется эксплантом . Выделение и манипуляции с клетками обычно проводят в специальном стерильном боксе - ламинарном шкафу (рис. 8а ).
Рисунок 7. Схема выделения клеток из ткани. Фрагмент ткани, полученный прижизненно (биопсией) или после смерти, измельчают механически и обрабатывают протеолитическими ферментами, расщепляющими внеклеточный матрикс (трипсином, коллагеназой, гиалуронидазой, папаином или их комбинациями). В дополнение к ферментам используют кальций-связывающие соединения (хелаторы), которые забирают кальций у молекул клеточной адгезии и ослабляют их связь между собой и с внеклеточным матриксом. Добавление ДНКазы позволяет предотвратить склеивание клеток в тягучие сгустки за счет электростатических взаимодействий с высвободившейся из поврежденных клеток ДНК. После этого клетки отделяют от обломков матрикса (дебриса) центрифугированием и/или фильтрацией и высаживают в культуральные флаконы или чашки Петри.
У некоторых тканей нет внеклеточного матрикса или клетки не связаны с ним, что существенно упрощает процедуру выделения. Это относится, главным образом, к клеткам крови и их предшественникам, находящемся в костном мозге. Благодаря легкости выделения и сохранности поверхностных молекул для этих клеток наиболее хорошо изучено разнообразие типов и пути их формирования из стволовой клетки крови (гемопоэтической СК).
После выделения клетки помещают в питательную среду и растят в чашках Петри или флаконах в атмосфере углекислого газа (5% CO 2) и близкой к 100% влажности в CO 2 -инкубаторах (рис. 8б ). Питательная среда состоит из физиологических солей, буфера pH, аминокислот, витаминов и глюкозы, а также белковых ростовых и питательных факторов (см. врезку ниже). Добавляемый к среде индикатор феноловый красный позволяет визуально контролировать pH и придает среде красный цвет.
Рисунок 8а. Основное оборудование для культуральных работ - ламинарный шкаф. Ламинарный шкаф обеспечивает равномерный вертикальный поток стерильного воздуха, защищая культуру клеток от микробного заражения.
Рисунок 8б. Основное оборудование для культуральных работ - CO 2 -инкубатор. Углекислый газ в CO 2 -инкубаторе, во-первых, позволяет лучше воспроизвести условия in vivo , а, во-вторых, необходим для поддержания pH среды, в которой, как правило, используется бикарбонатная CO 2 -зависимая буферная система. В инкубаторе поддерживается близкая к 100% влажность, что предотвращает испарение жидкости и концентрирование ее компонентов.
Белковые ростовые и питательные факторы
Белковые факторы являются наиболее тонким местом при культивировании клеток. Самым распространенный источник этих факторов - сыворотка животных, обычно телячьих эмбрионов, реже лошадиная или из такого же животного, что и сами клетки. Клеткам добавляют цельную фильтрованную сыворотку с разбавлением до 1–10%. При исследовании действия каких-либо веществ на клетки (факторов роста, белковых гормонов, цитокинов) сыворотка создает сильный фон, который необходимо снижать, выращивая клетки без сыворотки (депривация) в течение 2–72 ч перед экспериментом. Использование сыворотки почти не поддается стандартизации и является потенциальным источником инфекций, что существенно ограничивает ее применение при производстве биомедицинских продуктов. Альтернатива сыворотке - белковые добавки стандартного состава из очищенных и рекомбинантных белков.
Проблемы культивирования и воспроизводимости в экспериментах с живыми клетками (решения от «Диаэм»)
Некоторые культуры очень чувствительны ко внешним воздействиям или колебаниям химического состава среды, в связи с чем возникает ряд вопросов:
- Как привести условия культивирования in vitro к условиям, сопоставимым с условиями in vivo ? Некоторые процессы, происходящие в живых организмах, требуют создания специальных условий (микроокружения) для клеток.
- Как организовать длительный эксперимент и вести наблюдение в динамике? Клеточные культуры - идеальный объект для постановки длительных экспериментов. Но возникает проблема гомеостаза окружающей среды: клетки постоянно потребляют питательные вещества и выделяют метаболиты. Если решать вопрос простой сменой культуральной среды, то концентрация веществ в среде между заменами будет не постоянной. Кроме того, культуру клеток придется регулярно вынимать из инкубатора, для того чтобы сменить среду или произвести наблюдение под микроскопом.
- Как обеспечить защиту культуры клеток от контаминации бактериями, микоплазмами и грибами, которые могут свести на нет все усилия по выделению клеток из тканей?
- Как добиться воспроизводимости эксперимента? Клетки - живые объекты, на поведение которых могут повлиять даже незначительные факторы: частое открывание дверцы инкубатора, разное время пребывания культуры вне инкубатора, освещение при наблюдении культур под микроскопом - все это может оказать существенное влияние на появление артефактов в эксперименте. Так что вторая задача - это добиться стабильности параметров эксперимента.
Решение:
Раковые клетки даже в организме сильно отличаются от нормальных, а в культуре это отличие только увеличивается. Так, многие раковые линии имеют увеличенный набор хромосом (анеуплоидия), что делает их более устойчивыми к повреждению ДНК. Кроме этого, многие типы раков вызваны вирусными инфекциями, передающимися и клеточным культурам, что не позволяет использовать эти клетки в производстве вакцин (см. ниже). В связи с этим в фармакологии и научных исследованиях широко востребованы линии «нормальных» - не раковых - клеток.
Именно производство вакцин послужило основным мотивом получения культуры «нормальных» клеток. С этой целью Леонард Хейфлик (рис. 10б ) выделял клетки из абортивного материала и обнаружил наличие предела числа делений клеток в культуре, получившего название предела Хейфлика . Для человеческих клеток этот предел составляет 50–70 делений и обусловлен укорочением теломер - фундаментальным механизмом старения клеток.
В 1965 году Хейфлик получил линию фибробластов легкого WI-38 (рис. 10а ), которая смертна, но была наработана и заморожена в достаточным количестве, чтобы обеспечить исследования по всему миру и по сегодняшний день . Благодаря человеческому происхождению, отсутствию вирусных инфекций и раковой трансформации эта линия нашла широкое применение в производстве вакцин. Сейчас, однако, фармкомпании опасаются, что конечный ресурс данной линии не позволит им завершить начатые исследования, и переходят на другие линии. В настоящее время эта линия широко используется для изучения молекулярных механизмов старения .
Некоторым компромиссом между раковыми и нормальными являются иммортализованные клетки: полученные из нормальной ткани, они приобрели способность к неограниченному числу делений. Такой переход к бессмертию может происходить либо спонтанно, либо в результате искусственного введения определенных генов или слияния с раковыми клетками, как в случае гибридoм . «Бессмертие» клеткам могут придать онкогены: большой Т-антиген вируса SV40, H-Ras, c-myc, E1A. Эти гены по сути вызывают опухолевую трансформацию клеток со всеми вытекающими недостатками (нестабильность генома, потеря физиологических функций и т.д.). Наиболее деликатный и получающий все большее распространение способ иммортализации - это введение в клетку гена теломеразной обратной транскриптазы (TERT) , которая достраивает теломеры и предотвращает их укорачивание при делении (рис. 11). За открытие теломеразы в 2009 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине .
Хотя такая трансдукция тоже является, по сути, онкогенной, она позволяет лучше сохранить физиологические функции и меньше дестабилизировать геном по сравнению с трансдукцией другими онкогенами. Также стоит отметить, что этот метод работает не для всех клеток: например, он не подходит для Т- и B-клеток.
Рисунок 11. Концевые участки хромосом - теломеры - укорачиваются при каждом клеточном делении, и при их истощении в клетке запускается механизм самоуничтожения. Теломеры у позвоночных состоят из повторяющихся последовательностей нуклеотидов TTAGGG. При каждом делении эти участки укорачиваются, но теломераза TERT предоставляет собственную одноцепочечную ДНК в качестве матрицы, с которой сама синтезирует сначала одну цепь, а потом ДНК-полимераза достраивает и вторую цепочку ДНК теломер. Таким образом теломераза способна поддерживать бессмертие клеток.
Дифференцированные клетки (которые приобрели свою конечную специализацию) составляют бoльшую часть клеток организма и практически не делятся. Будучи основными составляющими и «рабочими лошадками» во всех органах и тканях, они служат мишенью действия большинства лекарств, что делает их весьма востребованными для исследований. В культуре их можно получить путем направленной дифференцировки плюрипотентых стволовых клеток в нужный тип клеток (см. далее), однако этот путь имеет существенные технические и, в случае человеческих клеток, еще и этические сложности.
Наиболее распространенными культурами дифференцированных клеток являются первичные клеточные культуры - клетки, выделенные из зрелой ткани и не пассированные in vitro (рис. 12). Число делений таких клеток критически зависит от условий культивирования, но редко составляет более 5–10 раз. Исключением являются стволовые, прогениторные и некоторые специализированные клетки, например, активированные Т- и B-лимфоциты. Кроме того, при длительном культивирование первичная культура склонна к замещению фибробластами.
Многие исследования выполняются именно на первичных клеточных культурах, обладающих рядом преимуществ по сравнению с раковыми и иммортализованными клетками:
- Они гораздо лучше соответствуют клеткам in vivo : нейроны проводят электрические импульсы, гепатоциты секретируют альбумин, макрофаги фагоцитируют бактерии и т.д.
- Если говорить о клетках животных, они легко доступны при наличии вивария - остается лишь получить их (что, впрочем, довольно трудоемко). Доступность человеческих клеток определяется типом ткани: распространены культуры эндотелиальных клеток из пуповинной вены (HUVEC, рис. 12г) и мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани, источниками которых служат побочные продукты акушерства и хирургии соответственно.
- Они несут генотип донора, а поэтому могут использоваться для изучения причин патологий конкретного пациента на молекулярном уровне.
Культуры клеток человека, мыши, крысы, кролика и других животных собраны в коллекциях, хранящихся в жидком азоте при температуре −196 °C (рис. 13а ). Наиболее полная коллекция - ATCC в США - насчитывает более 4600 клеточных культур эукариот. В МГУ сейчас создают уникальный по своим масштабам депозитарий живых систем «Ноев ковчег» , в котором среди всевозможных образцов живых объектов есть и клетки животных и человека (рис. 13б ). Некоторые институты тоже имеют свои коллекции: например, в ИБХ РАН коллекция организована по принципу облачного хранилища с общим журналом и клетками, распределенными по разным лабораториям.
Линии клеток из коллекций можно купить; они существуют почти для каждого типа опухоли и здоровой ткани и детально охарактеризованы. Это позволяет подобрать наиболее подходящие для конкретного исследования линии и сравнивать результаты с полученными ранее в своей или в других лабораториях.
«Диаэм»: все что нужно для работы с культурами клеток
Оборудование для клеточных технологий:
Культуральный пластик, среды, сыворотки, заменители, добавки:
Материал предоставлен партнёром - компанией «Диаэм»
Использование клеток в научных исследованиях
Клеточные культуры являются прежде всего инструментом для научных исследований. Какие возможности дает этот инструмент и для чего его можно использовать? Для клеток в культуре имеется богатый арсенал методов манипуляции и анализа: некоторые входят в 12 методов настоящего спецпроекта , а о многих других рассказывают отдельные статьи на «Биомолекуле». Здесь мы кратко остановимся на основных, но перед этим обсудим уникальные преимущества клеточных культур как модельных объектов.
В отличие от клеток в организме, для клеток в культуре исследователь полностью определяет внешние условия. Хотя эти условия часто и не соответствуют условиям in vivo , воспроизводимость и контроль позволяют ставить точные эксперименты и выявлять ответ клеток на определенные стимулы. Для изучения внутриклеточных процессов эта возможность уникальна, но надо помнить, что, чем сильнее клетки в культуре отличаются от клеток в организме, тем больше вероятность, что механизмы этих процессов тоже будут отличаться.
В клетке находится отнюдь не разбавленный раствор, используемый в биохимических и структурных исследованиях, а очень плотное и насыщенное микроокружение (crowded environment ) (рис. 14 и видео 2). Как следствие, активности молекул в искусственном растворе и «в жизни» иногда отличаются на несколько порядков. Именно поэтому клетка является гораздо более адекватной моделью при изучении активностей и взаимодействий биомолекул и при анализе воздействия потенциальных лекарств на молекулы-мишени в фармакологии.
Видео 2. Трехмерная реконструкция различных внутриклеточных структур в срезе из рисунка 14. подпись
Желтый - эндоплазматический ретикулум, синий - мембранно-связанные рибосомы, оранжевый - свободные рибосомы, светло-зеленые нити - микротрубочки, голубой - плотные коровые везикулы, белый - клатрин-негативные везикулы, светло-красный - клатрин-содержащие везикулы, пурпурный - клатрин-негативные компартменты, полости со светло- и темно -зелеными внутренними и внешними поверхностями - митохондрии. Отдельные молекулы и комплексы малого размера не отображены.
Как доставить ген в клетку?
Если интересующая нас молекула - белок, то самый простой способ поместить его в клетку и изучить - это заставить его синтезироваться прямо «на месте», введя внутрь клетки ген этого белка. Существует множество методов доставки генов в клетки (рис. 15) , как на основе чисто физико-химических принципов (трансфекция ), так и с использованием вирусов в качестве носителя (трансдукция ).
Эффективность трансфекции существенно зависит от типа клеток и методики: для раковых и иммортализованных клеток это обычно 30–80%, однако для первичных клеток - редко более 10%. Исключением является метод электропорации, который иногда позволяет добиться высокой эффективности доставки генов в первичные культуры. Химические методы трансфекции не предназначены для встраивания введенного гена в геном клетки, и со временем введенная ДНК теряется .
Небольшая доля ДНК все-таки может закрепиться в геноме при трансфекции и передаваться по наследству, что позволяет получить линию со стабильной экспрессией введенного гена. Отбор ведется путем селекции таких клеток по устойчивости к антибиотику (вместе с исследуемым геном обычно вставляют и ген, обеспечивающий такую устойчивость) или с помощью нескольких циклов клеточной сортировки.
Рисунок 15. Методы трансфекции и трансдукции. Для внедрения гена в клетку необходимо преодолеть внешнюю мембрану. Чаще всего для этого используют наноразмерные комплексы ДНК с липидными везикулами (липофекция), полимерными носителями или кристаллами кальция, которые сами поглощаются клеткой. Также можно временно продырявить мембрану с помощью электрического разряда - электропорации. Для случаев, когда ген нужно ввести лишь в несколько клеток (например, при изучении единичных нейронов), используют метод микроинъекции. В случае трансдукции используют вирусные частицы, в которые вместо части их собственного генома помещен необходимый ген. При этом вирусы сохраняют способность проникать в клетки, эффективно доставлять ген до ядра и, в случае некоторых вирусов, встраивать его в ДНК клетки.
Методы вирусной трансдукции имеют ряд преимуществ перед трансфекцией: высокая эффективность в отношении первичных клеточных линий, возможность встраивания гена в геном, применимость in vivo и избирательность действия вирусов на определенные типы клеток и тканей.
Для трансфекции создают искусственные вирусные частицы, снаружи похожие на натуральные вирусы и проникающие в клетку по тем же механизмам. Но внутри вместо части собственной ДНК они несут нужные исследователю гены и лишены программы саморепликации (то есть, такие частицы не заразны). Сегодня широко применяется около десятка генно-инженерных конструктов на базе различных вирусов. Для изменения избирательности вирусных частиц они могут быть дополнительно модифицированы заданными поверхностными молекулами.
Отредактируй это
Сейчас возможности клеточных технологий выходят на новый уровень после недавнего прорыва в методах редактирования генома на основе системы CRISPR/Cas-9 . Методика уже активно используется, и в продаже имеются наборы для избирательного удаления определенных генов из клеток (генетический нокаут). Преимуществом CRISPR/Cas-9 является простота по сравнению с доступными прежде методами редактирования генома (цинковыми пальцами, TALEN) . С помощью CRISPR/Cas-9 можно не только удалять и выключать гены, но и менять их и восстанавливать. На CRISPR/Cas-9 сегодня возлагают большие надежды в лечении моногенных наследственных заболеваний .
Да будет свет
Относительная простота введения желаемых генов в клетки открывает доступ к богатым возможностям, пожалуй, самого мощного на сегодня инструмента молекулярной биологии - генетически кодируемых флуоресцентных белков . Они позволяют отслеживать отдельные клетки в организме и даже молекулы в клетках, окрашивать определенные органеллы, изучать межмолекулярные взаимодействия и конформацию белков, измерять концентрации вторичных посредников (Ca 2+ , H 2 O 2 , цАМФ, H + , АТФ/АДФ, НАДН и др.), визуализировать и определять активность различных белков .
Помимо этого, в последние пять лет широкое распространение получила оптогенетика - метод, в котором с помощью генетически кодируемых светочувствительных белков можно управлять клеточными процессами с высоким временным и пространственным разрешением, буквально посветив в нужную область лазером (рис. 16) .
Рисунок 16. Оптогенетические конструкции позволяют с помощью лазера в заданной точке клетки и в заданное время запускать всевозможные процессы: 1 - ток ионов через мембрану и электрические импульсы, 2 - активность генов, 3 - активность белков, 4 - активность рецепторов и передачу сигналов в клетки, 5 - поглощение веществ снаружи, 6 - взаимодействия между белками, 7 - перемещение внутриклеточных везикул, 8 - синтез и деградацию белков, 9 - дыхательную цепь митохондрий и гибель клетки, 10 - передачу сигнала вторичными посредниками.
Флуоресцентные белки и оптогенетика проявляют весь свой потенциал в связке с современными методами флуоресцентной микроскопии . Эти методы достигли чувствительности единичных молекул при пространственном разрешении в несколько десятков нанометров, а при временнoм - до нескольких десятков микросекунд (рис. 17). Хотя такое пространственное разрешение и ниже, чем у электронной микроскопии, наличие временнoго разрешения (то есть применимость к живым клеткам) и возможность анализировать одновременно несколько молекул делают методы оптической микроскопии уникальными для широкого круга задач.
Рисунок 17. Пространственное и временнoе разрешение современных методов оптической микроскопии высокого разрешения. Обозначения: FRET - Forster resonant energy transfer (Фёрсторовский резонансный перенос энергии ); SPT - single particle tracking (микроскопия траекторий единичных частиц); PALM/STORM - photoactivation localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy (фотоактивированная локализационная микроскопия/микроскопия стохастической оптической реконструкции); STED - stimulated emission depletion (микроскопия подавления стимулированного испускания ); FCS - fluorescence correlation spectroscopy (флуоресцентная корреляционная спектроскопия); TIRF - total internal reflection (микроскопия полного внутреннего отражения); SIM - structured illumination microscopy (микроскопия структурированного освещения); - confocal microscopy (конфокальная микроскопия).
Типирование и сортировка
Еще одним мощным методом, который применим только к клеткам in vitro и ex vivo (сразу после выделения), является проточная цитометрия - поштучное исследование клеток в потоке жидкости: клетки по одной проходят через луч лазера, а специальные детекторы ловят сигнал флуоресценции и светорассеяния от освещенной лазером клетки. В отличие от микроскопии, она является исходно количественным методом, то есть позволяет точно измерить интенсивность флуоресценции и обладает высокой производительностью: скорость обработки достигает миллиона клеток в минуту. Это позволяет проводить «перепись» гетерогенных клеточных популяций, коими являются все первичные клеточные культуры. В частности, ей нет альтернатив при идентификации, подсчете и сортировке редких в популяции клеток, таких как стволовые клетки или антиген-специфичные лимфоциты, которых может быть лишь несколько клеток на миллион. Наибольшее распространение цитометрия нашла в иммунологии для анализа субпопуляций лейкоцитов без перевода их в культуру. Важной разновидностью цитометрии является клеточная сортировка в потоке, которая позволяет не только анализировать, но и выделять отдельные субпопуляции из гетерогенных клеточных смесей с чистотой более 99%.
От клеток к организму с помощью стволовых клеток
До этого мы рассматривали традиционные методы работы с клетками, многие из которых предложены во второй половине прошлого столетия. В то время это были передовые технологии, которые впоследствии внесли существенный вклад в развитие биомедицинской науки и молекулярной биологии, а сейчас являются частью обыденной лабораторной практики. Сегодня передовые клеточные технологии позволяют достичь впечатляющих результатов. Однако в научных и, в особенности, научно-популярных статьях авторы часто склонны преувеличивать масштаб открытия и замалчивать сложности и ограничения. Это создает несколько искаженную картину, в которой уже сегодня где-то есть врачи, которые печатают органы на 3D-принтере, избавляют людей от ВИЧ и слепоты и способны вылечить практически любой рак. Действительно, успехи клеточных технологий позволяют надеяться, что это и правда станет возможным в будущем, но пока ведущие специалисты призывают не торопиться с прогнозами, поскольку организм и ткань гораздо сложнее, чем просто сумма составляющих клеток.
Эмбриональные стволовые клетки
Рисунок 20а. Стимуляция формирования эмбриоидных телец в подвешенных каплях.
Рисунок 20б. Культивирование клеток в камере Максимова. В ней капля с кусочком ткани или клетками помещается на малое покровное стекло. С помощью капельки воды и капиллярных сил малое покровное стекло адгезируется к большому, которое, в свое очередь, кладется на основание и герметизируется парафином.
Справочная информация по работе с культурами клеток от «Диаэм»
Хотите узнать больше о тонкостях работы с культурами клеток или увидеть, как организована клеточная лаборатория?
Дополнительная информация по теме «Клеточные технологии».
Микроорганизмы существенно отличаются друг от друга по морфологии, размерам клеток, отношению к кислороду, по потребностям к ростовым факторам, способности ассимилировать разные компоненты субстрата и т. д.
Из более 100000 известных видов микроорганизмов в промышленности используют относительно мало – около 100 видов. Они должны соответствовать следующим требованиям:
1. Расти на дешёвых и доступных субстратах;
2. Обладать высокой скоростью роста биомассыи давать высокую продуктивность целевого продукта при экономичном потреблении питательного субстрата;
3. Проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов (рис. 2.1);
Рис. 2.1.Микроорганизмы, используемые в промышленном синтезе
различных соединений
А – Аcetobacter
aceti
; Б – Aspergillus
niger
; В – Penicillium
chrysogenum
; Г – Lactobacillus
delbruecki
; Д – Производство левана при ферментации среды, содержащей Zymomonas
mobilis
4. Быть генетически однородными, стабильными в отношении продуктивности и требований к питательному субстрату, а такжеусловиям культивирования;
5. Быть устойчивыми к фагам и другой посторонней микрофлоре;
6. Быть безвредными (не обладать патогенными свойствами) для людей и окружающей среды;
7. Желательно, чтобы продуценты были термофильными и ацидофильными, так как в этом случае легче предохранить ферментируемый субстрат от инвазии посторонней микрофлоры;
8. Целевой продукт биосинтеза должен иметь экономическую и народнохозяйственную ценность и легко выделяться из сброженного субстрата.
Возрастающий интерес представляют анаэробные микроорганизмы, поскольку при культивировании не требуют энергоёмких аэрирующих устройств.
Сверхсинтез,
т. е. способность микроорганизма синтезировать определённый продукт в количествах, превосходящих его физиологические потребности, довольно часто встречается в природе. Нередко тот или иной продукт обмена веществ (органические кислоты, спирты, антибактериальные вещества), выделяемый микроорганизмом в окружающую среду, является токсичным для других видов и служит продуценту как средство защиты обитаемого пространства или как резерв питательного вещества. Микроорганизмы с такими свойствами первыми были привлечены к хозяйственной деятельности человека в тысячелетней давности и был проведён стихийный отбор наиболее продуктивных форм. Сейчас такие природные штаммы микроорганизмов, иногда после сознательного отбора, применяют для производства микробной биомассы (микробного белка) в качестве бактериальных азотных удобрений, биопестицидов, в производстве пищевых продуктов и в других отраслях народного хозяйства. Однако основной контингент промышленных микроорганизмов представлен искусственно селекционными штаммами.
В настоящее время впромышленности применяют три вида штаммов:
1. Природные штаммы, нередко улучшенные естественным или искусственным отбором;
2. Штаммы, изменённые в результате индуцированных мутаций;
3. Штаммы культуры, полученные методами генной или клеточной инженерии.
Принципы селекции организмов.
Начиная сознательную селекцию микроорганизмов, человек ставил целью создать промышленные организмы с необычными для диких микробов свойствами. Методологически эту цель человек решает двумя путями:
1. Коррекцией генетической информации микробной клетки, исключая не желаемые для промышленного синтеза свойства и усиливая нужные признаки.
2. Индукцией совершенно новой информации в генетической программе клетки.
Для этого необходимо также решить следующие задачи:
1. Существенно увеличить продуктивность, свойственную данному виду микробов и его продукту обмена веществ;
2. Генетически запрограммировать биосинтез таких веществ, которые несвойственны данному виду или даже несвойственны микробному миру.
В отличие от селекции культурных растений и домашних животных, имеющей тысячелетнюю историю и богатый опыт, целенаправленный отбор и селекция микроорганизмов начались только после узнавания микромира и развивались параллельно с достижениями генетики как научной дисциплины.
Селекционируя любой живой организм, человек опирается на естественные движущие силы эволюции – наследственные изменения и отбор положительных экземпляров. Однако микроорганизмы, как объект селекции, имеют ряд особенностей:
1. Выращивание микробной культуры из одной клетки – обычный для микробной селекции приём – приводит к тому, что в руках селекционера в качестве исходного материала селекции всегда оказывается особь клона (имеющего генетическую однообразность). С другой стороны, клон микроорганизмов быстро достигает такой численности, что за счёт естественных мутаций превращается в популяцию – совокупность клеток с разными генотипами;
2. Большинство микроорганизмов гаплоидные, с одним экземпляром хромосом, поэтому у них нет скрытой изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов;
3. У большинства микроорганизмов, имеющих промышленное значение, до сих пор не известна способность к гибридизации (половому размножению). Это означает, что селекцию клеток можно вести только вегетативным путём;
4. Микроорганизмы характеризуются исключительно быстрой сменой поколений, поэтому возможностей для отбора положительных экземпляров у селекционера микробиолога значительно больше. Оценку выбранного микроорганизма можно провести за считанные дни выращивания в отличие от макроорганизмов, где результаты работы видны через несколько лет;
5. Селекционер микроорганизмов имеет огромное число индивидуумов для отбора, что принципиально расширяет его возможности, но для оценки продуктивности каждого клона требуется трудоёмкая работа.
Культуру, подлежащую селекции, можно выбрать из собранных в коллекции культур (музейные культуры); можно использовать известные промышленные продуценты; можно изолировать микробы из природных субстратов.
Представления о биохимии и физиологии микроорганизмов ориентируют селекционера на определённые группы микроорганизмов с наиболее вероятным потенциалом сверхсинтеза
интересующего вещества. Продуценты антибиотиков, главным образом, встречаются среди грибов аскомицетов и актиномицетов, сверхсинтез аминокислот легче получить у коринебактерий, внеклеточные ферменты часто синтезируют дрожжи. Главные этапы селекции микроорганизмов отражены на рисунке 2.2.
Рис. 2.2.
Схема селекции микроорганизмов
Таблица 2.1. Группы методов клеточной технологии
Две группы методов, данной технологии, представлены в табл. 2.1.
Первые три, из указанных методов, стали традиционными, другие находятся на начальных этапах разработки. Наконец, есть такие методы, которые явно вышли из ранга вспомогательных, ускоряющих селекцию технологий. К ним можно отнести криосохранение генофонда – технологию, в настоящий момент приобретшую экологическую направленность; или клональное микроразмножение растений, тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных и других инфекций.
Методы клеточной инженерии позволяют значительно ускорить традиционный процесс селекции. Биотехнология позволяет также скрещивать растения, которые в обычных условиях не скрещиваются рис. 2.2. – 2.6.
Одна из наиболее важных технологий, из перечисленных выше – оплодотворение in vitro , помогает предотвратить прогамную несовместимость , которая может быть вызвана рядом следующих причин:
1. Генетически детерминированное (определённое) несоответствие секрета рыльца материнского растения и пыльцы отцовского, которое тормозит рост пыльцевых трубок на рыльце пестика;
2. Несоответствие длины столбика пестика и пыльцевой трубки, в результате чего пыльцевая трубка не достигает семяпочки (гетеростилия);
3. Тканевая несовместимость партнёров, приводящая к остановке роста пыльцевой трубки в любой момент её прорастания, от рыльца пестика до микропиле семяпочки (гаметофитный тип несовместимости).
Преодоление прогамной несовместимости возможно благодаря выращиванию в стерильных условиях изолированной завязи с нанесённой на неё пыльцой или изолированных кусочков плаценты с семяпочками, рядом с которыми, или непосредственно на ткани которых, культивируется пыльца.
Значительным препятствием в селекции служит постгамная несовместимость , вызванная разновременным развитием зародыша и эндосперма при отдалённой гибридизации. В результате образуются невсхожие щуплые семена. Получить растение из таких семян можно только при использовании метода эмбриокультуры, т.е. выращивания изолированного зародыша на искусственной питательной среде in vitro. Метод эмбриокультуры широко применяют при межвидовой гибридизации овощных растений, для микроразмножения ценных гибридов, для клеточной селекции.
Большое значение имеет создание гаплоидов , позволяющее ускорить процесс селекции в 2-3 раза. Использование гаплоидных клеток и гаплоидных растений способствует обнаружению экспрессии введённого в клетку генома, редких рекомбинаций, рецессивных мутаций, которые в диплоидных растениях, как правило, маскируются доминантными генами. Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Обрабатывая гаплоидные клетки колхицином, можно добиться удвоения числа хромосом и получить диплоидные гомозиготные растения.
Методы создания дальнородственных гибридов
На данный момент большую роль в развитии растениеводства играет использование достижений генной инженерии и биотехнологии. Существует ряд мнений, биотехнология и генетически модифицированные растения на современном этапе выращивания растениеводческой продукции позволят решить экологические, энергетические и продовольственные проблемы, стоящие перед человечеством, посредством создания и использования новых организмов, продуктов, полученных с помощью методов генной инженерии, культуры органов и тканей in vitro и др.
Биотехнология и генная инженерия - науки, смотрят в будущее человечества...
Современная биотехнология растений - сумма технологий, развитые с молекулярной и клеточной биологии растений - является новой стадией в развитии технологии селекции растений. С ее помощью улучшения признаков может проходить на уровне индивидуального гена. Отдельные гены, которые определяют определенный признак, могут быть идентифицированы, изолированы, введенные, исключены или модифицированы в генотипе или сорте растения, за ними может проводиться отбор.
Вклад биотехнологии в растениеводство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений, разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельскохозяйственного производства. Методами генной и клеточной инженерии созданы высокопроизводительные и устойчивые против вредителей, болезней и других негативных факторов сорта сельскохозяйственных растений. Разработанная техника оздоровления растений от инфекций, что особенно важно для культур, которые размножаются вегетативно. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков, разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты последних от вредителей и болезней, бактериальные удобрения. Одним из актуальных вопросов биотехнологии является управление процессами азотфиксации и фотосинтеза, возможность введения соответствующих генов в геном культурных растений.
На современном этапе развития для интенсификации селекции эффективно использование таких биотехнологических методов: культура изолированных тканей, клеток и органов растений, клеточная селекция и генная инженерия. Они дают возможность за короткий срок создать и размножить ценный исходный высокопроизводительный материал, гетерозисных гибриды и сорта сельскохозяйственных растений. Разработка основ метода культуры тканей растительных организмов имеет сравнительно короткую историю и начинается с исследований, выполненных Габерландт в 1902 году. Однако каждое открытие, сделанное в этой области, нашло применение в прикладных исследованиях. Все проблемы, которые решаются в культуре in vitro, можно разделить на три основные группы:
1) сохранение генетической информации клеток (микроклональное размножения и депонирование, культура зародышей, пыльников и семенных зачатков)
2) изменение генетической информации путем мутагенеза под влиянием физических и химических факторов (культура каллуса, суспензий, протопластов)
3) перенос и интеграция генетической информации (генно инженерное конструирование растений с новыми признаками, соматическая гибридизация).
Основные направления развития биотехнологии в растениеводстве: 1) повышение содержания белка и незаменимых аминокислот в продукции сельскохозяйственных растений, достигается созданием так называемых генетически модифицированных организмов (ГМО), прежде всего трансгенных растений. Они приобретают хозяйственно-ценных признаков, в результате переноса генов, которые предопределяют, в частности от бактерий. Приоритетным признано вывода азотфиксирующих сортов зерновых культур; 2) получение бактериальных удобрений (азотфиксирующих бактерий), биопестицидов; 3) создание сортов и гибридов культурных растений, устойчивых к болезням, вредителям. Так, в США выращивают растения томатов, картофеля, хлопчатника, что приобрели устойчивость к насекомым; растения томатов, картофеля, устойчивые к патогенным вирусам. Получены сорта растений, устойчивых к гербицидам сплошного действия, что значительно облегчает борьбу с сорняками и удешевляет технологию выращивания, поскольку исчезает необходимость в применении селективных гербицидов.
Следует отметить, что среди ученых нет единодушия относительно возможного эффекта исследований по генной инженерии, влияния их на здоровье и безопасность человека, а также на функционирование экологических систем.
Существуют крайние взгляды, согласно которым биотехнология должна быть запрещена, поскольку знания о ней недостаточны для обеспечения полной безопасности человека. Высказывается и противоположное мнение: применение генной инженерии безопасное и требует минимального контроля. При этом основным аргументом является то, что принципиального различия между генной инженерией и селекцией нет. К тому же при генной инженерии выполняются известные, заранее спланированные модификации, а скорость процесса выше.
Свидетельством высоких темпов развития биотехнологии является, в частности, то, что в 1997г. В США и Канаде трансгенные кукурузу, сою, рапс, сахарная свекла выращивали на миллионах гектаров. Трансгенная соя только в США занимала 12%, кукуруза - 6, хлопчатник - 13% всех посевных площадей этих культур.
По заключению экспертов ФАО, в 2030 г.. Весь прирост производства продукции растениеводства будет достигнуто за счет новых сортов растений.
Ведущее место в биотехнологических исследованиях заняли корпорации "Дюпон", "Новартис", "Монсанто", "Рон-Пуленк", "Карсил".
Генетическая инженерия открывает перед селекцией растений новые перспективы, возможность переноса в них генов от бактерий, грибов, экзотических растений и даже человека и животных, в том числе и генов устойчивости, является недостижимым для экспериментального мутагенеза и традиционной селекции. Революционным свершением в генетической трансформации растений стало обнаружение природного вектора - агробактерий для переноса генов и разработка метода микробомбардування растительных объектов микрочастицами металлов с предварительно нанесенной чужеродных ДНК. Три выдающиеся достижения физиологии растений создали основу для интеграции технологии рекомбинантных ДНК в генно-инженерную биотехнологии растений. Во-первых, открытие фитогормонов, которые регулируют рост и развитие растений. Во-вторых, разработка методов культивирования клеток и тканей растений in vitro (эти методы дали возможность выращивать клетки, ткани и целые растения в стерильных условиях и проводить их селекцию на селективных средах). Потро, установление феномена тотипотентности соматических растительных клеток, который открыл путь к регенерации из них целых растений.
На сегодняшний день генетическая инженерия сельскохозяйственных растений развивается преимущественно в русле классической селекции. Основные усилия ученых сосредоточены на защите растений от неблагоприятных (биотических и абиотических) факторов, улучшении качества и уменьшении потерь при хранении продукции растениеводства. В частности, это повышение устойчивости к болезням, вредителям, заморозков, солонцеватости почвы и т.д., удаление нежелательных компонентов из растительных масел, изменение свойств белка и крахмала в пшеничной муке, улучшения лежкости и вкусовых качеств овощей и др. По сравнению с традиционной селекцией, основными инструментами которой являются скрещивания и отбор, генная инженерия дает возможность использования принципиально новых генов, которые определяют агрономически важные признаки, и новых молекулярно-генетических методов мониторинга трансгенов (молекулярные маркеры генов), что во много раз ускоряют процесс создания трансгенных растений. Селекционеров привлекает возможность целенаправленного генетического "ремонта" растений. Важным направлением является создание генетически модифицированных растений (ГМР) с признаком мужской стерильности. Кроме того, благодаря генетической модификации растения могут выполнять не свойственную им ранее функцию. Примером является корнеплоды сахарной свеклы, которые накапливают вместо сахарозы низкомолекулярные фруктами, бананы, которые используют как съедобную вакцину. Благодаря введению генов бактерий высшие растения приобретают свойства разрушать чужеродные органические соединения (ксенобиотики), загрязняющих окружающую среду. Выращивание ГМР, устойчивых к широкому спектру болезней и насекомых-вредителей, может существенно снизить, а в дальнейшем свести к минимуму пестицидную нагрузки на окружающую среду.
При рассмотрении проблемы возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду обсуждаются в основном такие основные аспекты:
Сконструированы гены будут переданы с пыльцой близкородственными диким видам, и их гибридное потомство приобретет свойства повышенной семенной продуктивности и способность конкурировать с другими растениями;
Трансгенные сельскохозяйственные растения станут сорняками и вытеснят растения, которые растут рядом;
Трансгенные растения станут прямой угрозой для человека, домашних и диких животных (например из-за их токсичности или аллергенности).
Еще одним важным аспектом является получение трансгенных растений с лучшей способностью использовать минеральные вещества, что, кроме усиления их роста, будет препятствовать смыва таких соединений в грунтовые воды и попадание в источники водоснабжения.
Гарантией против нежелательных последствий генетической модификации растений является законодательное регулирование распространения ГМР и разработка связанных с этим методов оценки экологического риска. Кроме того, значительная внимания уделяется достаточное информированности агрономов, селекционеров, СЕМЕНОВОД, потенциальных покупателей об особенностях продуктов из генетически модифицированных растений. В Украине и ряде других стран приняты законы, которые предупреждают несанкционированное распространение трансгенных семенного материала, обеспечивающего мониторинг в посевах, а также маркировки пищевых продуктов, изготовленных из продуктов ГМР или их добавлением.
В Украине законодательно не разрешено выращивать генетически модифицированные сорта. Это, возможно, одно из правильных решений, которое было принято в области аграрной политики. Будет большой ошибкой для Украины переход к выращиванию ГМ-сортов уже сейчас. Есть еще много нереализованных резервов роста урожайности за счет технологических мероприятий. Не вдаваясь в дискуссию о вреде или безвредности генетически модифицированных сортов, следует отметить, что они для Украины еще не время, потому что не будут способствовать ни росту урожайности, ни улучшению экономических показателей. Только создадут проблему с выходом сельскохозяйственной продукции на мировой рынок, снизят ее цену и возможность реализации.
Биотехнология - важный, но не единственный элемент научно-технического прогресса в аграрном секторе, поэтому необходим комплексный подход к этому вопросу с учетом альтернативных технологий. Одним из таких направлений развития является органическое земледелие.
Плодородие почвы создает " живое вещество " , которая состоит из миллиардов почвенных бактерий, микроскопических грибков, червей и других живых организмов. Переделывая органические растительные остатки и минеральные вещества, бактерии обеспечивают питание червей, которые существенно улучшают структуру и плодородие грунта.
Суть плодородия почв заключается в "" кормления бактерий и других живых существ ", которые живут в фунте. Необходимо накормить сначала микробов и червей, а они, в свою очередь, накормят растения. Ни минералы, ни органика, сами по себе не переходят в усваиваемую форму. Эту функцию выполняют жители фунтов, о которых и необходимо заботиться в первую очередь. Такая постановка вопроса в проблеме фунтов требует от агрономов изменения фадицийного мышления, отказа от глубокой отвальной вспашки. Интенсивная химизация полей уничтожила микрофлору и животных фунт сообщества, которые являются основными воспроизводителями плодородия грунта.
Почвы, в которых преобладают анабиотических или регенеративные микроорганизмы, является исключительно плодородными. Растения, выросшие на таких фунтах, прекрасно развиваются, они здоровые, устойчивые к болезням и вредителям. Такие фунты без всяких химикатов, пестицидов и искусственных удобрений демонсфують постоянное увеличение плодородия. Если же в фунте преобладают дегенеративные или патогенные микроорганизмы, развитие растений ослаблен, они не устойчивы к различным заболеваниям и вредителям и требуют допинга в виде искусственных удобрений и пестицидов. К сожалению, такой деградировавший, истощенное состояние фунтов имеет тенденцию к расширению даже в странах с высоким уровнем агротехнологий. Интенсивная химизация полей, применение пестицидов и искусственных удобрений, вместе с тяжелым сельскохозяйственным оборудованием, уничтожают микрофлору грунта.
Практика показала, что улучшить питательный режим фунтов, преодолеть вредителей и болезни сельскохозяйственных культур массовым применением химических средств не удается. В естественных, здоровых агроценозах растение живет в окружении полезных микроорганизмов, и только они способны воспроизводить среду, поддерживать нужный для комфортного существования живых существ баланс питательных веществ, а значит - максимально реализовывать потенциал урожайности.
Кроме экологических факторов влияют и чисто экономические: производство и внесения удобрений и СЗР пофебуе значительных энергозатрат. К примеру, в развитых странах на производство азотных удобрений вифачають почти фетину энергии, потребляемой в сельском хозяйстве. Не меньшую проблему представляет и дефицит сырья для производства фосфорных удобрений, обусловливает их высокую стоимость.
Поэтому в мире популяризируются идеи биоорганической земледелия, при котором применение химических удобрений и пестицидов допускается минимально или совсем не допускается. Сейчас мировой рынок биотехнологий для сельского хозяйства и пищевой промышленности оценивается почти в 50 млрд. Американских долларов и ежегодно растет на 20-30%.
Нужно учитывать тот факт, что генетически модифицированные сорта до сих пор почти не выращивают в Европе. Есть только экспериментальные посевы на площади 1-3 тыс. Га. Только в Испании отведено площади до 100 тыс. Га. Но это незначительное количество общей пашни в Европе (В. В. Лихочвор, 2001 и 2006).
План лекции
Тема 5,6. Препарат для сельского хозяйства. Белок одноклеточных микроорганизмов
ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ
МОДУЛЬ 2.
Форма проведения лекции: мозговая атака
1 Биотехнология и растениеводство.
2 Биотехнология и животноводство.
3 Технологическая биоэнергетика.
4 Производство кормового белка.
5 Использование дрожжей и бактерий.
6 Использование водорослей и микроскопических грибов.
Проблема для решения: области применения биотехнологии в сельском хозяйстве.
Студенты высказывают идеи для решения этой задачи. Затем идеи анализируются группой экспериментов при помощи и консультировании преподавателя. Правило мозговой атаки – высказываются любые идеи вплоть до самых абсурдных, запрещается критика идей в момент атаки. Все идеи записываются ведущим, и обеспечивается их обозрение участниками. Такая лекция активизирует мыслительную деятельность студентов, развивает эвристические способности.
Культурные растения страдают от сорняков, грызунов, насекомых-вредителей, нематод, фитопатогенных грибов, бактерий, вирусов, неблагоприятных погодных и климатических условий. Перечисленные факторы наряду с почвенной эрозией и градом значительно снижают урожайность сельскохозяйственных растений. Огромный ущерб в картофелеводству наносят колорадский жук, а также гриб Phytophtora -возбудитель ранней гнили (фитофтороза) картофеля.
Кукуруза подвержена опустошительным «набегам» южной листовой гнили, ущерб от которой в США в 1970 г. был оценён в 1 млрд. долларов.
В последние годы большое внимание уделяют вирусным заболеванием растений. Наряду с болезнями, оставляющими видимые следы на культурных растениях (мозаичная болезнь табака и хлопчатника, зимняя болезнь томатов), вирусы вызывают скрытые инфекционные процессы, значительно снижающие урожайность сельскохозяйственных культур и ведущие к их вырождению.
Биотехнологические пути защиты растений от рассмотренных вредоносных агентов включают:
Выведение сортов растений, устойчивых к неблагоприятным факторам;
Химические средства борьбы (пестициды), с сорняками (гербициды), грызунами (ратициды), насекомыми (инсектициды), нематодами (нематоциды), фитопатогенными грибами (фунгициды), бактериями, вирусами.;
Наряду с защитой растений ставится задача повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, их пищевой (кормовой) ценности, создание сортов растений, растущих на засоленных почвах, в засушливых и заболоченных районах. Разработки нацелены на повышение энергетической эффективности различных процессов в растительных тканях, начиная от поглощения кванта света и кончая ассимиляцией СО 2 и водно-солевым обменом.